【正文】 患者 T 細胞 功能的影響。 21 （二）預期目標 1． 爭取 獲得多個 RA 相關的新的候選抗原和表位。 17． 設計、合成、篩選，針對 RA 相關炎癥新靶 點的特異性 siRNA。 14． 對項目組前期發(fā)現(xiàn)的 RA 關聯(lián) SNP 進行進一步基因定位工作，并在大樣本中驗證。 10． 分析 FLS 中 Wnt/DKK 不同分子對于 FLS 增殖活化的影響。 6． T 細胞二個亞群（ Vγ1/Vγ4）產生 IFNγ 和 IL4 的分子機制研究。 2． 合成 GlcNAc糖蛋白。 4. 新型生物制劑對 RA 骨破壞的抑制作用研究 1） OPGHSP 重組蛋白對 RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。 2. 新型免疫調節(jié)分子對 RA 自身免疫調控及治療作用研究 1）娃 兒藤堿類似物的免疫調節(jié)機制及對 CIA 鼠關節(jié)炎的抑制作用研究。 研究內容： 本課題將在項目組成員既往研究以及本項目前述研究基礎之上，針對 RA 自身免疫反應的啟動、調控、炎癥反應及骨破壞等四個關鍵環(huán)節(jié)，探索 RA 干預的新策略，并通過與傳統(tǒng)緩解病變抗風濕藥（ DMARDs）甲氨蝶呤比較，評價新型免疫治療策略的療效及安全性。一方面進一步對已發(fā)現(xiàn)的新遺傳易感基因及其致病作用進行系統(tǒng)研究，另一方面為臨床早期診斷尋找新的特異性靶標，既有理論意義，又有重要的臨床應用價值。 經(jīng)費比例： 20% 承擔單位： 北京大學、南開大學 課題負責人： 栗占國 學術骨干： 尹芝南、穆榮、洪章勇、何菁、葉華 課題 RA 易感基因及早期診斷靶標研究 預期目標： 鑒定 RA 新的易感基因、 miRNA 表達譜及新的血清蛋白標志分子，尋找 RA新的生物靶標用于臨 床早期診斷。 2） MSCs 對 CIA 小鼠的抑制作用研究。 研究內容： RA 自身免疫應答過程除 了 MHC肽 TCR 誘導的 T 細胞活化反應外，還受細胞因子、小分子及調節(jié)性 T 細胞等因素的負調控影響，本項目通過對調節(jié)性 T細胞、間充質干細胞及小分子的免疫調控機制進行系統(tǒng)深入的研究，為 RA 免疫干預策略提供新的靶向。 16 本課題的主要研究內容如下 1. RA 關節(jié)滑液中炎癥細胞亞群及其炎癥因子在 RA 滑膜炎癥啟動時相的作用與調控機制。 經(jīng)費比例： 15% 承擔單位： 北京大學、中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學 課題負責人： 高曉明 學術骨干： 吳玉章、徐曉軍、牟芝蓉、呂平、孫曉麟、劉霞 課題 RA 相關炎癥及免疫損傷機制 預期目標： 系統(tǒng)闡明 RA 滑膜炎癥和骨破壞的發(fā)生機制和調控通路，為進一步發(fā)展臨床早期防治 RA 骨質疏松和骨破壞的臨床新策略 提供理論與實驗依據(jù)。 2. 固有免疫相關 T 細胞亞群參與 RA 發(fā)病的分子機制研究 1) γδT 細胞二個主要亞群（ Vγ1/Vγ4）產生 IFNγ 和 IL4 的分子機制研究。 本課題的主要研究內容如下： 15 1. 特異性自身反應性 T細胞免疫應答的分子機制研究 1） RA自身反應性 T細胞 免疫生物學特性 分析。 2) 糖基化修飾對自身抗原誘導免疫反應的影響。 2）修飾抗原在 HLADRB1 特異性 T 細胞激活中的作用。 2） 抗原肽與 RA 易感 HLADRB1 分子的結合能力研究。 2. 建立新抗原的化學和酶學修飾平臺，闡明翻譯后修飾在 RA 發(fā)病中的作用。 課題一、二、三是針對 RA 發(fā)病的自身免疫啟動、異常免疫應答、炎癥及組織破壞三個環(huán)節(jié)中 RA 免疫病理反應發(fā)生發(fā)展的新機制的探討 ，對 RA 抗原特異性自身免疫活化通路中關鍵性調控分子進行了系統(tǒng)研究，課題四是對課題一至三闡述的 RA 自身應答的負調控機制研究，包括新發(fā)現(xiàn)的調節(jié)性 T 細胞、間充質干細胞和小分子等抑制性細胞和分子。在 RA 的基礎研究向臨床轉化、創(chuàng)新性理論等方面達到國際一流水平。 4. 創(chuàng)新的研究方法和原創(chuàng)性結果： 本團隊成員在糖組學、抗原表位組學等前沿學科均有原創(chuàng)性研究，在抗原糖基化修飾方面建立了新的糖蛋白合成方法，在抗原表位功能研究方面創(chuàng)立了一系列新的表位預測和實驗檢測方法，這些先進方法與豐富的臨床資源相結合，保證了本項目應用基礎研究的創(chuàng)新性研究成果。 3）具備免疫干預方法評價的一系列特有的轉基因動物模型。 3）結構合理的優(yōu)秀科研團隊保證了研究方案的順利實施：優(yōu)秀的中青年學術骨干，具備良好的大型科研課題實施的工作能力，掌握實驗涉及的所有先進技術，保證了項目的實施和技術問題的解決。以上 6 個方面的技術路線如下： RA 相關新型自身抗原鑒定及修飾特點研究 隨機肽庫 RA 模擬肽 信息學 分析 免疫共沉淀 天然抗原 RA 新抗原 糖芯片檢測 合成糖基化修飾蛋白 單抗免疫親和層析結合液質聯(lián) 用鑒定新 修飾 抗原 已知修飾 抗原 表位分析 BIAOWIE HLADRB1 分子結合 能力 HLADRB1 特異性 T 細胞株 RA 患者 T 細胞 新抗原誘導鼠關節(jié)炎模型 已完成 前期組學研究 蛋白質組 滑膜 cDNA 文庫 8 RA 的自身免疫應答機制研究 抗原 T 表位 表位改造 Mimogen 表位數(shù)據(jù)庫 免疫信息學分析 In Silico 實驗 /預測 遞送系統(tǒng) 免疫應答特征 作用機理 自身反應性 T 細胞 糖表位 TCR特性 活化相關膜分子 T 細胞活化功能 T 細胞亞型 亞型分布 RA 患者外周血單個核細胞 流式 1. 應用抗 亞型特異性 抗體清除 小 鼠 γ δ T 細胞亞群 2. 分離 Vγ1和 Vγ4 γδ T細胞轉移至 膠原性關節(jié)炎 小鼠 新靶向在 膠原性關節(jié)炎中的治療實驗 對膠原性關節(jié)炎的影響 分選 動物實驗驗證 闡明 γδT 細胞亞型在 RA 中的作用 9 RA 相關炎癥及免疫損傷機制： RA 細胞免疫負調控機理研究： 已完成 間充質干細胞 RA 相關 小分子 上調或下調 RA 患者 外周血不同 細胞 亞群中小分子 表達 CIA Treg 亞群 關節(jié)炎評分 關節(jié)病理 X 線評分 新生 兒 臍帶 血 RA 患者 T 細胞功能 致炎性 細胞因子 分泌 T 細胞增殖 細胞活化 及分化功能變化 細胞因子轉化 增殖與凋亡 T 細胞表面功能蛋白表達 外周血不同細胞亞群中上述小分子水平的變化 差異表達芯片 小分子作用 靶 點 芯片鑒定 RA 患者 PBMC 中小分子表達譜 靜脈注射 不同亞型分布 亞型分選 不同亞型 Treg 對致病性 T 細胞的抑制功能 Fexp3/IL10 Tg 誘導 CIA CIA 靜脈注射 滑膜細胞體外培養(yǎng) 炎癥細胞體外培養(yǎng)（ Th17/Th1） 滑膜細胞與 Th17/Th1共培養(yǎng) 對滑膜細胞增殖功能的影響 對滑膜細胞產生炎性因子的影響 對 滑膜細胞產生骨破壞介質 的影響 骨破壞相關信號通路變化 靜脈注射 給CIA 小鼠 觀察 對 骨破壞、炎 性因子分泌及滑膜增生的影響 IL17 下游轉錄分子與途徑鑒定 IL6/IL8 基因敲除小鼠驗證IL6/IL8 在 IL17通路中作用 Th17 RA 滑膜炎癥和損傷作用與調控途徑 合成靶向 DKK1 基因的 siRNA 去 IL17 血清過繼轉移，觀察CIA 發(fā)病率 10 RA 易感基因及早期診斷靶標研究： RA 干預新策略的研究： 免疫啟動環(huán)節(jié) 免疫調控環(huán)節(jié) 炎癥環(huán)節(jié) 骨破壞環(huán)節(jié) RA 相關炎癥靶點 OPGHSP 重組蛋白 RANKL TNF 樣區(qū)疫苗 人源化抗 CYR61 單抗 以 CIA 鼠模型為平臺 機制研究 療效評價 HLADRB1 特異性變構肽 HDACi 同工酶 RA 特異性血清標志分子 大樣本 RA患者中的驗證 基因芯片掃描 利用多種分子生物學技術研究新 RA易感基因的致病機制 EXONCAPTURE 高通量 Solexa 分析 國外報 道的RA相關 SNP 新 RA相關SNP 鑒定得到的 CNP基因 全基因組 CGH芯片篩選 CNP基因 (已完成 ) 蛋白組學鑒定 臨床診斷靶標的應用研究 RA易感基因 高通量Solexa 分析 高通量Solexa 分析 RA 差異 miRNA 譜 11 （三）可行性分析： 1. 前期工作基礎 ： 1）團隊內前期取得了大量研究成果，本項目是對這些原創(chuàng)性研究的進一步深入和轉化，保證了項目預期目標和研究方案的可行性。 自身反應性 T 細胞的功能及免疫調控 是連接自身抗原始動和炎癥效應階段的橋梁，是 RA 病理免疫反應的核心，深入探討其作用機制，是 RA 發(fā)病機制研究必不可少的組成部分。 6 三、研究方案 (一 )總體研究思路： RA 是一種復雜性狀疾病，多種關鍵性因素在 RA 發(fā)病過程的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，因此，必須從 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進行深入系統(tǒng)的研究，才能使其發(fā)病機制得到充分認識。 11. 探討一系列針對 RA 發(fā)病不同環(huán)節(jié)的新的免疫干預策略，在 RA 動物模型中觀察其療效，并探討其作用機制。 7. 探討間充質干細胞對 RA 免疫負調控中的作用機制，探索新的 RA 免疫干預策略 。 3. 系統(tǒng)分析 RA 特異性 修飾 抗原特征及致病機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)。 上述 主要研究內容緊緊圍繞關鍵科學問題， 從 RA 的自身免疫應答啟動、異常免疫應答及炎癥和組織破壞等不同階段深入探討 RA 發(fā)病的免疫學機制，并對RA 臨床診斷新靶標和免疫干預新方法進行研究，是各課題密切關聯(lián)的系統(tǒng)性的基礎和臨床基礎研究工作，基礎與臨床有機結合，有望全面系統(tǒng)地闡述 RA 發(fā)病各環(huán)節(jié)的關鍵性分子，并使我國 RA 的創(chuàng)新性研究達到國際前沿水平。 5. RA 易感基因及早期診斷靶標研究 ：本團隊已經(jīng)建立了先進的 RA 遺傳易感性研究平臺，本項目從 RA 易感基因鑒定、單核甘酸多態(tài)性和拷貝數(shù)多態(tài)性分析等層面對 RA 發(fā)病的免疫遺傳學機制進行系統(tǒng)研究，進一步大樣本分析前期發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因的遺傳 特性和致病機制。本項目組前期對上述負調控機制在 RA 中的3 作用進行了大量研究。 主要研究內容包括： 1. RA 相關新型自身抗原鑒定及修飾特點研究 ： 在前期組學基礎上，對本團隊已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的新 RA 自身抗原進行表位功能、 HLADRB1 結合特性、 T 細胞活化、關節(jié)炎誘導能力等實驗研究，并對這些新抗原的翻譯后修飾特征以及修飾后抗原功能的改變進行系統(tǒng)分析，從 分子、細胞、動物、 RA 患者外周血等不同層面闡述上述新抗原在 RA 中的致病作用，使 RA 發(fā)病機制研究在分子水平上取得突破性進展。 本項目將緊密圍繞這一關鍵問題，從 RA 自身抗原鑒定和特征性修飾特征、 RA 特異性自身免疫反應及負調控機制、滑膜炎癥和骨破壞的新分子機制以及免疫遺傳學等方面對 RA 發(fā)病的免 疫學機制進行系統(tǒng)研究，并在此基礎上，尋找創(chuàng)新性及特異性的 RA 早期診斷和免疫干預的新方法。 4. RA 細胞免疫負調控機理研究 ：調節(jié)性 T 細胞、間充質干細胞等具有抑制功能的免疫細胞和小分子是近年來新發(fā)現(xiàn)的自身免疫負調控的重要靶標，在 RA中的功能及作用機制研究還剛起步。上述新型免疫負調控機制的深入研究將為 RA 免疫干預策略提供新的靶向。在前期研究基礎上，本項目利用獨有的一系列轉基因動物模型，從 RA 自身免疫反應的啟動、調控、炎癥反應及骨破壞等四個關鍵環(huán)節(jié)設計免疫干預策略，并進行體內實驗，以傳統(tǒng)緩解病變抗風濕藥（ DMARDs）為對照，對不同環(huán)節(jié)的免疫治療方法的療效及機制進行系統(tǒng)研究，為 RA 臨床治療靶向研究提供新的思路。 2. 對項目組前 期工作發(fā)現(xiàn)的一系列 RA 自身抗原，利用項目組成熟的表位功能研究和抗原修飾平臺，這些新抗原的致病機制進行系統(tǒng)研究，在此基礎上探索其臨床應用價值。 6. 闡明各調節(jié)性 T 細胞亞型在 RA 免疫負調控中的作用，為其臨床應用奠定基礎。 10. 探討 RA 特異性生物標志分子用于臨床診斷靶標的意義。 14. 人才培養(yǎng)：計劃培養(yǎng) 學術水平高、創(chuàng)新能力強的 中青年學術骨干 612 名，博士后、博士和碩士研 究生 2040 名，為 RA 標志性分子和發(fā)病機制的基礎和臨床研究形成 一支具有國際