【正文】 患者 T 細(xì)胞 功能的影響。 21 （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 爭取 獲得多個(gè) RA 相關(guān)的新的候選抗原和表位。 17． 設(shè)計(jì)、合成、篩選，針對 RA 相關(guān)炎癥新靶 點(diǎn)的特異性 siRNA。 14． 對項(xiàng)目組前期發(fā)現(xiàn)的 RA 關(guān)聯(lián) SNP 進(jìn)行進(jìn)一步基因定位工作，并在大樣本中驗(yàn)證。 10． 分析 FLS 中 Wnt/DKK 不同分子對于 FLS 增殖活化的影響。 6． T 細(xì)胞二個(gè)亞群（ Vγ1/Vγ4）產(chǎn)生 IFNγ 和 IL4 的分子機(jī)制研究。 2． 合成 GlcNAc糖蛋白。 4. 新型生物制劑對 RA 骨破壞的抑制作用研究 1） OPGHSP 重組蛋白對 RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。 2. 新型免疫調(diào)節(jié)分子對 RA 自身免疫調(diào)控及治療作用研究 1）娃 兒藤堿類似物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及對 CIA 鼠關(guān)節(jié)炎的抑制作用研究。 研究內(nèi)容： 本課題將在項(xiàng)目組成員既往研究以及本項(xiàng)目前述研究基礎(chǔ)之上，針對 RA 自身免疫反應(yīng)的啟動、調(diào)控、炎癥反應(yīng)及骨破壞等四個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探索 RA 干預(yù)的新策略，并通過與傳統(tǒng)緩解病變抗風(fēng)濕藥（ DMARDs）甲氨蝶呤比較，評價(jià)新型免疫治療策略的療效及安全性。一方面進(jìn)一步對已發(fā)現(xiàn)的新遺傳易感基因及其致病作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，另一方面為臨床早期診斷尋找新的特異性靶標(biāo)，既有理論意義，又有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。 經(jīng)費(fèi)比例： 20% 承擔(dān)單位： 北京大學(xué)、南開大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 栗占國 學(xué)術(shù)骨干： 尹芝南、穆榮、洪章勇、何菁、葉華 課題 RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究 預(yù)期目標(biāo)： 鑒定 RA 新的易感基因、 miRNA 表達(dá)譜及新的血清蛋白標(biāo)志分子，尋找 RA新的生物靶標(biāo)用于臨 床早期診斷。 2） MSCs 對 CIA 小鼠的抑制作用研究。 研究內(nèi)容： RA 自身免疫應(yīng)答過程除 了 MHC肽 TCR 誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞活化反應(yīng)外，還受細(xì)胞因子、小分子及調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞等因素的負(fù)調(diào)控影響，本項(xiàng)目通過對調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及小分子的免疫調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，為 RA 免疫干預(yù)策略提供新的靶向。 16 本課題的主要研究內(nèi)容如下 1. RA 關(guān)節(jié)滑液中炎癥細(xì)胞亞群及其炎癥因子在 RA 滑膜炎癥啟動時(shí)相的作用與調(diào)控機(jī)制。 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 北京大學(xué)、中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 高曉明 學(xué)術(shù)骨干： 吳玉章、徐曉軍、牟芝蓉、呂平、孫曉麟、劉霞 課題 RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制 預(yù)期目標(biāo)： 系統(tǒng)闡明 RA 滑膜炎癥和骨破壞的發(fā)生機(jī)制和調(diào)控通路，為進(jìn)一步發(fā)展臨床早期防治 RA 骨質(zhì)疏松和骨破壞的臨床新策略 提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2. 固有免疫相關(guān) T 細(xì)胞亞群參與 RA 發(fā)病的分子機(jī)制研究 1) γδT 細(xì)胞二個(gè)主要亞群（ Vγ1/Vγ4）產(chǎn)生 IFNγ 和 IL4 的分子機(jī)制研究。 本課題的主要研究內(nèi)容如下： 15 1. 特異性自身反應(yīng)性 T細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子機(jī)制研究 1） RA自身反應(yīng)性 T細(xì)胞 免疫生物學(xué)特性 分析。 2) 糖基化修飾對自身抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的影響。 2）修飾抗原在 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞激活中的作用。 2） 抗原肽與 RA 易感 HLADRB1 分子的結(jié)合能力研究。 2. 建立新抗原的化學(xué)和酶學(xué)修飾平臺，闡明翻譯后修飾在 RA 發(fā)病中的作用。 課題一、二、三是針對 RA 發(fā)病的自身免疫啟動、異常免疫應(yīng)答、炎癥及組織破壞三個(gè)環(huán)節(jié)中 RA 免疫病理反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制的探討 ，對 RA 抗原特異性自身免疫活化通路中關(guān)鍵性調(diào)控分子進(jìn)行了系統(tǒng)研究，課題四是對課題一至三闡述的 RA 自身應(yīng)答的負(fù)調(diào)控機(jī)制研究，包括新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和小分子等抑制性細(xì)胞和分子。在 RA 的基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化、創(chuàng)新性理論等方面達(dá)到國際一流水平。 4. 創(chuàng)新的研究方法和原創(chuàng)性結(jié)果： 本團(tuán)隊(duì)成員在糖組學(xué)、抗原表位組學(xué)等前沿學(xué)科均有原創(chuàng)性研究，在抗原糖基化修飾方面建立了新的糖蛋白合成方法，在抗原表位功能研究方面創(chuàng)立了一系列新的表位預(yù)測和實(shí)驗(yàn)檢測方法，這些先進(jìn)方法與豐富的臨床資源相結(jié)合，保證了本項(xiàng)目應(yīng)用基礎(chǔ)研究的創(chuàng)新性研究成果。 3）具備免疫干預(yù)方法評價(jià)的一系列特有的轉(zhuǎn)基因動物模型。 3）結(jié)構(gòu)合理的優(yōu)秀科研團(tuán)隊(duì)保證了研究方案的順利實(shí)施：優(yōu)秀的中青年學(xué)術(shù)骨干，具備良好的大型科研課題實(shí)施的工作能力，掌握實(shí)驗(yàn)涉及的所有先進(jìn)技術(shù)，保證了項(xiàng)目的實(shí)施和技術(shù)問題的解決。以上 6 個(gè)方面的技術(shù)路線如下： RA 相關(guān)新型自身抗原鑒定及修飾特點(diǎn)研究 隨機(jī)肽庫 RA 模擬肽 信息學(xué) 分析 免疫共沉淀 天然抗原 RA 新抗原 糖芯片檢測 合成糖基化修飾蛋白 單抗免疫親和層析結(jié)合液質(zhì)聯(lián) 用鑒定新 修飾 抗原 已知修飾 抗原 表位分析 BIAOWIE HLADRB1 分子結(jié)合 能力 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞株 RA 患者 T 細(xì)胞 新抗原誘導(dǎo)鼠關(guān)節(jié)炎模型 已完成 前期組學(xué)研究 蛋白質(zhì)組 滑膜 cDNA 文庫 8 RA 的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 抗原 T 表位 表位改造 Mimogen 表位數(shù)據(jù)庫 免疫信息學(xué)分析 In Silico 實(shí)驗(yàn) /預(yù)測 遞送系統(tǒng) 免疫應(yīng)答特征 作用機(jī)理 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞 糖表位 TCR特性 活化相關(guān)膜分子 T 細(xì)胞活化功能 T 細(xì)胞亞型 亞型分布 RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞 流式 1. 應(yīng)用抗 亞型特異性 抗體清除 小 鼠 γ δ T 細(xì)胞亞群 2. 分離 Vγ1和 Vγ4 γδ T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 膠原性關(guān)節(jié)炎 小鼠 新靶向在 膠原性關(guān)節(jié)炎中的治療實(shí)驗(yàn) 對膠原性關(guān)節(jié)炎的影響 分選 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 闡明 γδT 細(xì)胞亞型在 RA 中的作用 9 RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制： RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究： 已完成 間充質(zhì)干細(xì)胞 RA 相關(guān) 小分子 上調(diào)或下調(diào) RA 患者 外周血不同 細(xì)胞 亞群中小分子 表達(dá) CIA Treg 亞群 關(guān)節(jié)炎評分 關(guān)節(jié)病理 X 線評分 新生 兒 臍帶 血 RA 患者 T 細(xì)胞功能 致炎性 細(xì)胞因子 分泌 T 細(xì)胞增殖 細(xì)胞活化 及分化功能變化 細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化 增殖與凋亡 T 細(xì)胞表面功能蛋白表達(dá) 外周血不同細(xì)胞亞群中上述小分子水平的變化 差異表達(dá)芯片 小分子作用 靶 點(diǎn) 芯片鑒定 RA 患者 PBMC 中小分子表達(dá)譜 靜脈注射 不同亞型分布 亞型分選 不同亞型 Treg 對致病性 T 細(xì)胞的抑制功能 Fexp3/IL10 Tg 誘導(dǎo) CIA CIA 靜脈注射 滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng) 炎癥細(xì)胞體外培養(yǎng)（ Th17/Th1） 滑膜細(xì)胞與 Th17/Th1共培養(yǎng) 對滑膜細(xì)胞增殖功能的影響 對滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的影響 對 滑膜細(xì)胞產(chǎn)生骨破壞介質(zhì) 的影響 骨破壞相關(guān)信號通路變化 靜脈注射 給CIA 小鼠 觀察 對 骨破壞、炎 性因子分泌及滑膜增生的影響 IL17 下游轉(zhuǎn)錄分子與途徑鑒定 IL6/IL8 基因敲除小鼠驗(yàn)證IL6/IL8 在 IL17通路中作用 Th17 RA 滑膜炎癥和損傷作用與調(diào)控途徑 合成靶向 DKK1 基因的 siRNA 去 IL17 血清過繼轉(zhuǎn)移，觀察CIA 發(fā)病率 10 RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究： RA 干預(yù)新策略的研究： 免疫啟動環(huán)節(jié) 免疫調(diào)控環(huán)節(jié) 炎癥環(huán)節(jié) 骨破壞環(huán)節(jié) RA 相關(guān)炎癥靶點(diǎn) OPGHSP 重組蛋白 RANKL TNF 樣區(qū)疫苗 人源化抗 CYR61 單抗 以 CIA 鼠模型為平臺 機(jī)制研究 療效評價(jià) HLADRB1 特異性變構(gòu)肽 HDACi 同工酶 RA 特異性血清標(biāo)志分子 大樣本 RA患者中的驗(yàn)證 基因芯片掃描 利用多種分子生物學(xué)技術(shù)研究新 RA易感基因的致病機(jī)制 EXONCAPTURE 高通量 Solexa 分析 國外報(bào) 道的RA相關(guān) SNP 新 RA相關(guān)SNP 鑒定得到的 CNP基因 全基因組 CGH芯片篩選 CNP基因 (已完成 ) 蛋白組學(xué)鑒定 臨床診斷靶標(biāo)的應(yīng)用研究 RA易感基因 高通量Solexa 分析 高通量Solexa 分析 RA 差異 miRNA 譜 11 （三）可行性分析： 1. 前期工作基礎(chǔ) ： 1）團(tuán)隊(duì)內(nèi)前期取得了大量研究成果，本項(xiàng)目是對這些原創(chuàng)性研究的進(jìn)一步深入和轉(zhuǎn)化，保證了項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)和研究方案的可行性。 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞的功能及免疫調(diào)控 是連接自身抗原始動和炎癥效應(yīng)階段的橋梁，是 RA 病理免疫反應(yīng)的核心，深入探討其作用機(jī)制，是 RA 發(fā)病機(jī)制研究必不可少的組成部分。 6 三、研究方案 (一 )總體研究思路： RA 是一種復(fù)雜性狀疾病，多種關(guān)鍵性因素在 RA 發(fā)病過程的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，因此，必須從 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，才能使其發(fā)病機(jī)制得到充分認(rèn)識。 11. 探討一系列針對 RA 發(fā)病不同環(huán)節(jié)的新的免疫干預(yù)策略，在 RA 動物模型中觀察其療效，并探討其作用機(jī)制。 7. 探討間充質(zhì)干細(xì)胞對 RA 免疫負(fù)調(diào)控中的作用機(jī)制，探索新的 RA 免疫干預(yù)策略 。 3. 系統(tǒng)分析 RA 特異性 修飾 抗原特征及致病機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 上述 主要研究內(nèi)容緊緊圍繞關(guān)鍵科學(xué)問題， 從 RA 的自身免疫應(yīng)答啟動、異常免疫應(yīng)答及炎癥和組織破壞等不同階段深入探討 RA 發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，并對RA 臨床診斷新靶標(biāo)和免疫干預(yù)新方法進(jìn)行研究，是各課題密切關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)性的基礎(chǔ)和臨床基礎(chǔ)研究工作，基礎(chǔ)與臨床有機(jī)結(jié)合，有望全面系統(tǒng)地闡述 RA 發(fā)病各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵性分子，并使我國 RA 的創(chuàng)新性研究達(dá)到國際前沿水平。 5. RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究 ：本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)建立了先進(jìn)的 RA 遺傳易感性研究平臺，本項(xiàng)目從 RA 易感基因鑒定、單核甘酸多態(tài)性和拷貝數(shù)多態(tài)性分析等層面對 RA 發(fā)病的免疫遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，進(jìn)一步大樣本分析前期發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因的遺傳 特性和致病機(jī)制。本項(xiàng)目組前期對上述負(fù)調(diào)控機(jī)制在 RA 中的3 作用進(jìn)行了大量研究。 主要研究內(nèi)容包括： 1. RA 相關(guān)新型自身抗原鑒定及修飾特點(diǎn)研究 ： 在前期組學(xué)基礎(chǔ)上，對本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的新 RA 自身抗原進(jìn)行表位功能、 HLADRB1 結(jié)合特性、 T 細(xì)胞活化、關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)能力等實(shí)驗(yàn)研究，并對這些新抗原的翻譯后修飾特征以及修飾后抗原功能的改變進(jìn)行系統(tǒng)分析，從 分子、細(xì)胞、動物、 RA 患者外周血等不同層面闡述上述新抗原在 RA 中的致病作用，使 RA 發(fā)病機(jī)制研究在分子水平上取得突破性進(jìn)展。 本項(xiàng)目將緊密圍繞這一關(guān)鍵問題，從 RA 自身抗原鑒定和特征性修飾特征、 RA 特異性自身免疫反應(yīng)及負(fù)調(diào)控機(jī)制、滑膜炎癥和骨破壞的新分子機(jī)制以及免疫遺傳學(xué)等方面對 RA 發(fā)病的免 疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，并在此基礎(chǔ)上，尋找創(chuàng)新性及特異性的 RA 早期診斷和免疫干預(yù)的新方法。 4. RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究 ：調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等具有抑制功能的免疫細(xì)胞和小分子是近年來新發(fā)現(xiàn)的自身免疫負(fù)調(diào)控的重要靶標(biāo)，在 RA中的功能及作用機(jī)制研究還剛起步。上述新型免疫負(fù)調(diào)控機(jī)制的深入研究將為 RA 免疫干預(yù)策略提供新的靶向。在前期研究基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目利用獨(dú)有的一系列轉(zhuǎn)基因動物模型，從 RA 自身免疫反應(yīng)的啟動、調(diào)控、炎癥反應(yīng)及骨破壞等四個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)免疫干預(yù)策略，并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以傳統(tǒng)緩解病變抗風(fēng)濕藥（ DMARDs）為對照，對不同環(huán)節(jié)的免疫治療方法的療效及機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，為 RA 臨床治療靶向研究提供新的思路。 2. 對項(xiàng)目組前 期工作發(fā)現(xiàn)的一系列 RA 自身抗原，利用項(xiàng)目組成熟的表位功能研究和抗原修飾平臺，這些新抗原的致病機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，在此基礎(chǔ)上探索其臨床應(yīng)用價(jià)值。 6. 闡明各調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞亞型在 RA 免疫負(fù)調(diào)控中的作用，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 10. 探討 RA 特異性生物標(biāo)志分子用于臨床診斷靶標(biāo)的意義。 14. 人才培養(yǎng)：計(jì)劃培養(yǎng) 學(xué)術(shù)水平高、創(chuàng)新能力強(qiáng)的 中青年學(xué)術(shù)骨干 612 名，博士后、博士和碩士研 究生 2040 名，為 RA 標(biāo)志性分子和發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)和臨床研究形成 一支具有國際