【正文】 程中的自身免疫啟動(dòng)、異常免疫應(yīng)答、炎癥和組織破壞等各環(huán)節(jié)存在的關(guān)鍵性問(wèn)題為出發(fā)點(diǎn)，分別從自身抗原鑒定及修飾特點(diǎn)、自身免疫反應(yīng)機(jī)制、炎癥和免疫損傷機(jī)制、 RA 免疫負(fù)調(diào)控機(jī)制、易感基因及早期診斷靶標(biāo)以及免疫干預(yù)新策略等 6 個(gè)方面系統(tǒng)闡述 RA 發(fā)病機(jī)制，為RA 早期診斷和免疫治療提供新的靶標(biāo)。 2）團(tuán)隊(duì)內(nèi)長(zhǎng)期的廣泛合作為項(xiàng)目順利進(jìn)行奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，可使各課題間的密切聯(lián)系得以實(shí)現(xiàn)。 2）團(tuán)隊(duì)包括了多名長(zhǎng)江學(xué)者、跨世紀(jì)優(yōu)秀人才、國(guó)家杰出青年、百人計(jì)劃、北京市科技新星等優(yōu)秀科研人才，長(zhǎng)期從事 RA 臨床和基礎(chǔ)研究，并具備實(shí)施大型科研項(xiàng)目的能力。 3. 臨床特色： 本項(xiàng)目的實(shí)施需要大量臨床標(biāo)本，本項(xiàng)目具有豐富的臨床資源保證了項(xiàng)目的順利進(jìn)行，國(guó)際一流的臨床學(xué)者參與，保證了研究 方向和解決的關(guān)鍵問(wèn)題切實(shí)符合臨床需要，臨床應(yīng)用具有可行性。 2）具備課題實(shí)施需要的所有大型儀器。 （四）創(chuàng)新點(diǎn)與特色： 1. 提出了新的科學(xué)問(wèn)題： 本 項(xiàng)目圍繞 RA 自身免疫啟動(dòng)、異常免疫應(yīng)答、炎癥和組織破壞及干預(yù)策略等發(fā)病和治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，研究方向 具有創(chuàng)新性和突破性研究，對(duì) RA 新的分子機(jī)制及相關(guān)分子的探索具有重要意義。 3. 高起點(diǎn)的新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)： 本項(xiàng)目利用我們獨(dú)有的一系列轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型進(jìn)行RA 新的調(diào)控分子在動(dòng)物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制研究，實(shí)驗(yàn)涉及本課題組建立的IL33 轉(zhuǎn)基因鼠、 FOXP3/IL10 報(bào)告轉(zhuǎn)基因鼠、 RA 易感 HLADRB1*0405 轉(zhuǎn)基因鼠等，這些動(dòng)物模型均為本團(tuán)隊(duì)自建或合作構(gòu)建，為本團(tuán)隊(duì)獨(dú)有，利用這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，將對(duì)闡述常規(guī)實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行研究的新機(jī)制具有重要作用。 （五）課題相互關(guān)系及設(shè)置： 各課題間相互關(guān) 系 本項(xiàng)目擬從 RA 發(fā)病機(jī)制各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵問(wèn)題 出發(fā)，以本研究團(tuán)隊(duì)的大量前期工作為基礎(chǔ)，結(jié)合國(guó)外最新研究進(jìn)展設(shè)置課題?；A(chǔ)與臨床有機(jī)結(jié)合，全面地闡述 RA 免疫致病機(jī)制，為 RA 早期診斷和免疫干預(yù)提供創(chuàng)新性靶向，使我國(guó)在 RA 研究領(lǐng)域的工作從總體上達(dá)到國(guó)際前沿。為此，本項(xiàng)目擬設(shè)置六個(gè)課題： 課題一、 RA 相關(guān)新型自身抗原鑒定及修飾特點(diǎn)研究；課題二、 RA 的自身 免疫應(yīng)答機(jī)制研究；課題三、 RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制；課題四、 RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究；課題五、 RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究；課題六、 RA 干預(yù)新策略的研究。而且，課題組成員已在上述各領(lǐng)域進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究，不少成員間有多年的合作研究基礎(chǔ)和成果。課題五是對(duì)新發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因以及前四個(gè)課題中鑒定的新型生物標(biāo)志分子進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化研究，為這些 RA 特異性分子用于臨床診斷靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。 課題設(shè)置 課題 RA 相關(guān)新型自身抗原鑒定及 修飾特點(diǎn)研究 預(yù)期目標(biāo)： 1. 篩選和鑒定 出 多 個(gè) RA 發(fā)病相關(guān)的新抗原。 研究?jī)?nèi)容： 利用課題組成熟的抗原結(jié)構(gòu)、 T 細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，對(duì) RA 相關(guān)新型抗原進(jìn)行一系列功能研究，包括：抗原表位鑒定、 RA 易感 HLADRB1 結(jié)合特性、自身抗體產(chǎn)生、 T 細(xì)胞活化功能、關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)能力以及翻譯后修飾對(duì)抗原功能的影響。 本課題的主要研究?jī)?nèi)容如下： 1. 前期組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的新 RA 自身抗原結(jié)構(gòu)和 功能研究 1）新型 RA 相關(guān)抗原的表位分析 。 3）抗原肽在 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞激活中的作用。 2. 抗原表位組學(xué)基礎(chǔ)上 RA 特異性自身抗原的鑒定 、免疫應(yīng)答及關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)能力的影響 1） HLADR4/DR1 分子對(duì)本研究組前期鑒定的抗原肽的識(shí)別及結(jié)合作用的研究。 3）修飾抗原在 HLADR4 遺傳背景下誘 發(fā)關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究。 4. RA 相關(guān)抗原的糖基化修飾研究 1) 糖基化抗原的合成。 3) 糖芯片檢測(cè)。 研究?jī)?nèi)容： 在 RA的自身免疫應(yīng)答機(jī)制中，抗原特異性 T細(xì)胞 活化居于中心環(huán)節(jié)，本課題將從 RA患者抗原特異性 T細(xì)胞特性 、 抗原表位誘導(dǎo)的 T細(xì)胞活化 、 新發(fā)現(xiàn)的 T細(xì)胞表面分子免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制 以及 T細(xì)胞參與的調(diào)控機(jī)制 4個(gè)方面對(duì) RA自身免疫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)闡述。 2）抗原 T表位誘導(dǎo)特異性應(yīng)答的功能研究。 4）利用抗 T細(xì)胞抗體分析活化態(tài) T細(xì)胞表面參與免疫應(yīng)答調(diào)控的重要分子。 2) γδT 細(xì)胞二個(gè)主要亞群在 CIA 的作用：應(yīng)用抗 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對(duì)相應(yīng)的 Vγ1 和 Vγ4 T 細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)清除，觀察 Vγ1 或 Vγ4 γδT 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的影響。 4) T 細(xì)胞二個(gè)主要亞群在 RA 的作用：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中 Vγ1 和 Vγ4 的數(shù)量和功能。 研究?jī)?nèi)容： 在 RA 的炎癥啟動(dòng)、進(jìn)展及骨破壞過(guò)程中， Th17 等免疫細(xì)胞與滑膜細(xì)胞間的相互作用及分子調(diào)控機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。這些原創(chuàng)性研究必將使 RA 免疫調(diào)控的新分子機(jī)制得到認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步的免疫干預(yù)提供新型介入靶點(diǎn)。 2. RA 滑膜細(xì)胞活化的新的分子調(diào)控機(jī)制研究 1） Cyr61 在 RA 滑膜細(xì)胞活化中的作用研究。 3. RA 滑膜炎癥介導(dǎo)骨破壞的新機(jī)制 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 北京大學(xué)、上海交通大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 張卓莉 學(xué)術(shù)骨干： 李寧麗、張學(xué)武、陳適、周煒、王世瑤、王利、 沈佰華、賈園、任立敏 課題 RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究 預(yù)期目標(biāo)： 探討 Treg、間充質(zhì)干細(xì)胞和小分子參與 RA 免疫負(fù)調(diào)控的機(jī)制，為 RA 患者免疫干預(yù)治療提供新的靶向。 本課題的主要研究?jī)?nèi)容如下： 1. 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞在 RA 免疫致病機(jī)制中的作用研究 1）不同 Treg 亞群對(duì) CIA 自身免疫應(yīng)答的調(diào)控作用及其治療效應(yīng)。 2. 間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì) RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究 1） MSCs 對(duì) RA 患者 T 細(xì)胞功能的影響。 RA 免疫調(diào)控機(jī)制中的作用研究 17 1） RA 相關(guān)小分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)及功能研究。 3） RA 相關(guān)小分子對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的負(fù)調(diào)控作用研究。 研究?jī)?nèi)容： 遺傳是 RA 發(fā)病的重要因素之一，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)建立了先進(jìn)的 RA 遺傳易感性研究平臺(tái)，對(duì) RA 免疫遺傳學(xué)機(jī)制的深入研究是發(fā)現(xiàn)新的基因靶標(biāo)用于臨床診斷和治療的重要途徑。本課題是在這一主旨上進(jìn)行的臨床轉(zhuǎn)化研究。 本課題的主要研究?jī)?nèi)容如 下： 1． RA 易感 SNP 的篩選和鑒定 1）在前期工作基礎(chǔ)之上，研究相關(guān) SNP 位點(diǎn)在 RA 易感性中的作用及其機(jī)制。 2．前期組學(xué)篩選基礎(chǔ)上，候選 RA 易感 CNP 及其致病機(jī)制研究 3． RA 相關(guān)基因表達(dá)差異的研究 4． RA 特征 miRNA 分布及早期診斷靶標(biāo)研究 5. 血清生物標(biāo)志分子及 RA 相關(guān)多肽做為早期診斷靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)研究 1）雙向電泳 血清蛋白質(zhì)譜鑒定 18 2）血清蛋白指紋圖譜的鑒定及早期診斷靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)研究 3）新型自身抗體篩查研究 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 常曉天 學(xué)術(shù)骨干： 崔亞洲、潘繼紅、李茹、安媛、劉栩、趙燕 課題 RA 干預(yù)新策略的研究 預(yù)期目標(biāo)： 探討針對(duì) RA 發(fā)病不同環(huán)節(jié)的免疫干預(yù)新方法在膠原性關(guān)節(jié)炎的作用，為RA 免疫干預(yù)新策略研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本課題的主要研究?jī)?nèi)容如下： 1. 阻斷自身 免疫反應(yīng)的激活治療 RA 的實(shí)驗(yàn)研究 1） HLADRB1 特異性變構(gòu)肽的優(yōu)化和合成。 3） HLADRB1 特異性變構(gòu)肽對(duì) CIA 模型的抑制作用。 2）組蛋白乙?；敢种苿┟庖哒{(diào)節(jié)機(jī)制及治療作用研究。 2）合成的 siRNA 對(duì) CIA 鼠模型的治療作用研究。 2） RANKL TNF 樣區(qū)疫苗對(duì) RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。 經(jīng)費(fèi)比例： 20% 承擔(dān)單位： 首都醫(yī)科大學(xué)、南開大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 趙文明 學(xué)術(shù)骨干： 王鵬、王璞 玥 、李慎濤、沈杰、趙煒、王 煒 20 四、年度計(jì)劃 第一年度 （一）研究?jī)?nèi)容 1． 篩選 RA 特異的相關(guān)抗原和表位，并制備相應(yīng)的特異性抗體。 3． 進(jìn)行 T 細(xì)胞糖表位特異性抗體的制備 ，試制糖表位抗體檢測(cè)的 ELISA 試劑盒。 5． 分析不同抗原 T 表位排列方式對(duì)抗原性的影響。 7． 分析 RA 關(guān)節(jié)滑液中 Th17 和 Th1 炎性細(xì)胞亞群格局與相互作用。 9． 分析 RA 患者 FLS 中 Wnt/DKK 表達(dá)格局。 11． 析不同 Treg 對(duì) T 細(xì)胞活化的抑制作用，從而評(píng)價(jià)不同 Treg 亞群對(duì) CIA 免疫應(yīng)答的調(diào)控作用。 13． 對(duì) RA 調(diào)控相關(guān)小分子在患者外周血的表達(dá)進(jìn)行分析。同時(shí)進(jìn)行高通量 RA 易感 SNP 的篩選，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 RA 關(guān)聯(lián)基因。 16． HDAC 同功酶的結(jié)構(gòu)計(jì)算；合成首批分子。 18． OPGHSP 重組蛋白的原核表達(dá)、純化、復(fù)性，大量制備。 20． 抗 Cyr61 人源化單克隆抗體制備。 2． 研究可用于臨床檢測(cè)的 T 細(xì)胞糖表位特異性抗體 RA 診斷方法。 4． 明確不同 Treg 亞群對(duì) CIA 發(fā)病的不同調(diào)控作用。 6． 了解 RA 相關(guān)小分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況。 8． 力爭(zhēng)獲得與 HLADRB1 結(jié)合力更強(qiáng)，且能抑制 RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的新型變構(gòu)肽。 10． 力爭(zhēng)篩選出 針對(duì) RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)的特異性 siRNA。 12． 爭(zhēng)取獲得人源化抗 Cyr61 抗體表 達(dá)克隆及穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。 2． 合成雙天線型寡糖分子。分析不同 T 表位功能表達(dá)的構(gòu)象條件，明確 T 細(xì)胞表位特異性應(yīng)答與疾病相關(guān)性。 5． RAT 細(xì)胞表面抗原性的特點(diǎn)分析。 22 7． 明確炎癥因子 IL17 和相關(guān)炎癥因子對(duì) Cyr61 表達(dá) 的影響和參與滑膜細(xì)胞過(guò)度增生的作用。 9． 分析 Cyr61 和 Wnt/DKK 對(duì)于滑膜細(xì)胞 MMPs 表達(dá)格局及影響。 11． 利用 IL10/Foxp3 Tg 小鼠 CIA 模型，探討 MSCs 對(duì)小鼠 CIA 發(fā)生發(fā)展的預(yù)防和治療作用。 13． 篩選 RA 易感 CNP。 15． 進(jìn)行 首批 HDACi 分子的生物學(xué)測(cè)試。 17． 探討 OPGHSP 重組蛋白、 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗對(duì) CIA 模型的骨損傷防止作用和炎癥反應(yīng)的保護(hù)性作用。 19． 抗 Cyr61 人源化單克隆抗體制備。 2． 通過(guò)體外試驗(yàn)觀察糖表位特異性抗體和抗 T 細(xì)胞抗體對(duì) RAT 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。 4． 明確 Th17 等細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子對(duì)于 RA 滑膜炎癥的作用與調(diào)控機(jī)制。 6． 評(píng)價(jià) MSCs 對(duì)關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的抑制作用。 23 8． 發(fā)現(xiàn) RA 基因組中可能存在的 CNP。 10． 優(yōu)化或完善小分子化合物，獲得可選擇性調(diào)控 Treg 亞群分化的系列最佳娃兒藤堿類小分子化合物。 12． 力爭(zhēng)獲得 12個(gè)經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾而提高體內(nèi)穩(wěn)定性及特異性的針對(duì) RA相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)的 siRNA。 14． 評(píng)價(jià)出 OPGHSP 重組蛋白疫苗對(duì) CIA 鼠的療效。 16． 獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)抗 Cyr61 人源化抗體的克隆。 2． 進(jìn)行寡糖分子庫(kù)的合成，寡糖芯片的制備和測(cè)試。 4． 研究 RA患者血清中針對(duì) RAT細(xì)胞的調(diào)節(jié)性抗體的滴度與抗原特異性。 6． 分離純化 Vγ1 和 Vγ4 γδT 細(xì)胞，在體外擴(kuò)增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至關(guān)節(jié)炎小鼠，觀察不同亞群 γδ T 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 8． 分析 Wnt/DKK 調(diào)控 βcatenin、 RANKL、 OPG 等的表達(dá)和對(duì)炎癥因子產(chǎn)生能力和對(duì)于成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的初步影響。 10． 分析 RA 患者外周血 Treg、 Th Th17 分布，探討 Treg 分布變化與 Th24 Th17 分布的相關(guān)性。 12． 采用基因表達(dá)芯片比較上調(diào)或下調(diào) 小分子 表達(dá)后， 其在 相應(yīng)免疫細(xì)胞表達(dá)譜的差異，尋找差異表達(dá)的 RA 相關(guān)小分子 。 14． 使用前述經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)并篩選出的變構(gòu)肽對(duì) HLADRB1轉(zhuǎn)基因小鼠的 CIA模型進(jìn)行治療，綜合評(píng)價(jià)其治療效果。 16． 優(yōu)化 HDAC同功酶的結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè) HDAC與先導(dǎo) HDACi分子的結(jié)合模式；合成第二批 HDACi分子。觀察其 siRNA 對(duì) CIA 的治療效果及對(duì)小鼠的影響。 19． 探討 RANKL TNF 多肽疫苗發(fā)揮保護(hù)性效果的作 用機(jī)制。 20． 制備足量抗 Cyr61 人源化單克隆抗體，并用于小鼠 CIA 模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體系的治療實(shí)驗(yàn) （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 闡明獲得的修飾抗原是否具有特異的修飾以及相應(yīng)的修飾特點(diǎn)。 3． 明確 RA 患者體內(nèi)糖表位特異性抗體和抗 T 細(xì)胞抗體與疾病的相關(guān)性。 5． 了解不同亞群 T 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 7． 分析出不同亞群 Treg 對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用。 10． 明確差異表達(dá)的 RA 相關(guān)小分子 ，并預(yù)測(cè)出 可能的 作用靶點(diǎn)。 12． 確定經(jīng)前述篩選獲得的變構(gòu)肽對(duì) CIA 的實(shí)際治療效果。 14． 闡明 RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)對(duì)于 R