【正文】 PD 發(fā)病相關(guān)基因 Syn 和 PINK1激活膠質(zhì)細胞的過程中的作用，探討干預(yù)膠質(zhì)細胞活化的靶點，為防止 PD進行性發(fā)展提供線索。因此 本課題旨在 探討PD 患者中各種 NMS 的發(fā)生率、病因、發(fā)生機制及與臨床進程的關(guān)系，研 究和闡明與各種 NMS 發(fā)生相關(guān)的因素及其機制。 擬申請專利 12項。 研究目標： （一） PD 病的預(yù)警、早期診斷 獲得 PD 早期診斷的生物標記物（血清α SYN、 LRRK DJ1 抗體 /蛋白）； 通過分子設(shè)計、化學合成，制備系列小分子化合物及其 125I 和 18F 標記物等手段，完善神經(jīng)退行性疾病分子影像技術(shù)平臺，研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的PD 影像學診斷分子探針： （ 1）完成 [18F]AV133 、 99mTcTrodat1 及 G964 申報新探針藥物的各項臨床前研究并進行新藥臨床 研究申報； （ 2）研究設(shè)計針對α SYN 蛋白和 5HT 能神經(jīng)元的受體及轉(zhuǎn)運載體新的分子探針，評價其對 PD，帕金森病癡呆和路易體癡呆（ Dementia with Lewy Bodies）診斷和鑒別診斷的價值。 新假說： 將 DA 能神經(jīng)元特異表達蛋白、線粒體功能障礙、金屬離子特異性聚集和不同類型膠質(zhì)細胞交互作用等前期工作的新發(fā)現(xiàn)有機融合，提出黑質(zhì)部位神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞網(wǎng)絡(luò)相互作用的研究理念，系統(tǒng)揭示 PD 多巴胺能神經(jīng)元選擇性、進行性變性死亡的機制。主要研究基礎(chǔ)包括： 在 PD 的病因?qū)W研究中： （ 1）建立了 3000 多例 PD 全國多中心臨床數(shù)據(jù)庫、樣本庫，建立了 120xx 人的社區(qū)老年人群隊列；（ 2）發(fā)現(xiàn)多種基因突變 /多態(tài)性可能會增加個體的 PD 發(fā)生 風險；（ 3）初步證明了某些基因位點分型及其與吸煙、飲茶、農(nóng)藥接觸、腦外傷等環(huán)境暴露因素對 PD 發(fā)病風險的影響；（ 4）建立了 αSyn 基因轉(zhuǎn)染猴模型和毒素暴露食蟹猴模型；（ 5）研究了老化對正常猴 DA 能神經(jīng)元以及人腦黑質(zhì) αSYN 和 TH 表達的增齡性變化。 參加本項目的學術(shù)骨干絕大多數(shù)參與了原 973 項目的研究工作，并且根據(jù)研究工作的實際需要，增補了新生力量，使研究隊伍更趨合理，基礎(chǔ)和臨床搭配得當。經(jīng)過五年的磨合，已經(jīng)具備了很大的凝聚力，為新項目的完成 奠定了 堅實的團隊基礎(chǔ)。 3. 應(yīng)用 敲 除 鼠 ， 制 備MPTPPD 模型 ； 體外建立神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系 ；在MPTP/6OHDA/Lactacystin 建立的PD 動物模型 中 神經(jīng)營養(yǎng)因子合成、及其 p75Trk 神經(jīng)保護途徑；建立 PINK1 和 α Syn 基因異常表達的細胞及動物模型 。 3. 建立 PD 模型及共培養(yǎng)體系。 5. 按照 SFDA 放射性新藥申報要求完成 99mTcTrodat1 和[18F]AV133 的 各項試驗 ；明確GSK3α /β Ser21/9 磷酸化與 PD發(fā)生的關(guān)系及 GSK3β多肽抑制劑對 PD 動物的治療 作用；明確藥物在多種 PD 模型中的療效；確定藥物抗炎、抗氧化神經(jīng)保護機制；建立穩(wěn)定的 iPS 細胞的誘導、增殖、向神經(jīng)干細胞分化、神經(jīng)干細胞分選和體外擴增的方法體系。 2. 獲得 HSP22 的作用機理；確定 vav在 DA 神經(jīng)元易感性中的可能的作用；獲得自噬相關(guān)的的表達載體以及建立 EFGPLC3 穩(wěn)定表達細胞株，和自噬調(diào)控蛋白EGFPHax1 、 EGFPBclxl 及EGFPBeclin1 的穩(wěn)定表達細胞株；明確 Omi、 Parkin 和 PINK 對損傷線粒體的自 噬清除與否以及其對自噬相關(guān)蛋白的影響；小膠質(zhì)細胞內(nèi)鐵的水平影響其活化與功能。 系統(tǒng)中小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活和分布，及其激活與神經(jīng)元損傷的先后時間關(guān)系及相互作用；明確 PD 腦內(nèi)免疫異常和氧化應(yīng)激水平的改變；闡明活化星形膠質(zhì)細胞通過其釋放 BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子、激活 p75Trk途徑和下游細胞內(nèi)信號、發(fā)揮其DA 能神經(jīng)元的神經(jīng)保護效應(yīng)機制 ； 明確 PINK1 和 α Syn 對膠質(zhì)細胞活化的信號通路 。 2. 研究 vav 在 DA 神經(jīng)元選擇性變性中的作用和機理；進一步深入探討 Omi、 Parkin 和 PINK 調(diào)控的保護作用的信號通路；應(yīng)用細胞和動物模型研究環(huán)境因素（農(nóng)藥及藥物）對 Omi、 Parkin 和 PINK作用的影響；星形膠質(zhì)細胞釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)元鐵代謝的影響。 2. 力爭在 hsp22 研究中取得成果發(fā)表論文；發(fā)表可從信號通路角度闡述 Omi、 Parkin 和 PINK 的作用機制，明確激酶信號通路；闡述環(huán)境因素對 PD 相關(guān)蛋白引起的多巴胺能神經(jīng)元的損傷的影響機制；星形膠質(zhì)細胞通過神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF 影響神經(jīng)元鐵代謝。 2. 開展 GSTO1與選擇性退變機理的研究；建立 DJ1 的 SUMO 化位點突變動物 /細胞模型，明確作用靶位，在此基礎(chǔ)上篩選促進損傷線粒體清除的化合物； iNOS 的激活對膠質(zhì)細胞參與神經(jīng)元鐵代謝的影響。 3. 闡明 細胞功能（增殖、分化、遷移和生存）的調(diào)節(jié)作用及其與 PD 神經(jīng)損傷與修復的關(guān)系；明確PHOX/MMP9 與小膠質(zhì)細胞介導的免疫炎癥和氧化應(yīng)激的關(guān) 系，及其在 DA 能神經(jīng)元損傷和 PD發(fā)生發(fā)展中的作用；初步闡明p75Trk、 p75sortilin 分子表達和激活的相關(guān)調(diào)控機制、及其作為促進 DA 能神經(jīng)元生存和抑制凋亡的神經(jīng)保護治療新靶點的意義 ； 明確 α Syn 和 PINK1 引起自噬活化膠質(zhì)細胞的信號通路 。 5. 顯像探針自動化合成標記 SOP 的完善和應(yīng)用研究；新探針的放射性標記方法研究與應(yīng)用； 闡明 GSK3α /β調(diào)控 Bim 穩(wěn)定性的機制及其在神經(jīng)元死亡 /PD 發(fā)生中的作用；在急性和長期動物實驗中，檢測藥物有效劑量對重要組織器官的毒性作用，并系統(tǒng)進行藥物毒性、藥代動力學研究；建立攜帶特定基因突變 PD 患者的 iPS 細胞模型，研究細胞變性死亡機制和篩選抗 PD 藥物。 2. 明確保護作用化合物的功能機制；對線粒體損傷在 PD 中的作用提出新的觀點；抗氧化應(yīng)激的復合藥物和海洋藥物 PF 具有預(yù)防和治療 PD 的作用。 5. 顯像探針藥盒和制劑標準的制定及質(zhì)量控制研究；對新探針進行動物（模型）顯像評價和其它評價。 一、研究內(nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學問題 本項目將以 PD“黑質(zhì) 多巴胺能 神經(jīng)元選擇性、進行性變性死亡 ”為主的全身性病理機制作為關(guān)鍵科學問題。 擬通過大樣本病例 對照研究，探討 PD 風險基因變異對國人患 病風險的獨立和聯(lián)合效應(yīng)，建立多種 PD 關(guān)聯(lián)基因的相互作用模式。 NMS 對 PD 的臨床特點、預(yù)后、治療反應(yīng)及生活質(zhì)量具有重要影響，其發(fā)生與 αSYN 在黑質(zhì)外單胺 能 神經(jīng)元表達隨年齡增長、遺傳因素及環(huán)境因素的相互作用有關(guān)。 項目名稱： 惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的細胞表觀遺傳機制 首席科學家： 尚永豐 北京大學 起止年限： 至 依托部門： 教育部 二、預(yù)期目標 總體目標： 本項目 瞄準 表觀遺傳學 研究 的 前沿， 整合國內(nèi)優(yōu)秀 研究人員 ， 系統(tǒng)深入地開展惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的表觀遺傳學研究。 建立一整套適應(yīng)于惡性腫瘤表觀遺傳學研究的技術(shù)平臺和技術(shù)體系。前三 課題 分別從 DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼 RNA 三個不同角度，分析腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中表觀遺傳學改變，研究其相互之間的 作用 關(guān)系及分子調(diào)控機理；第四 課題將 對腫瘤 轉(zhuǎn)移過程中非常重要的現(xiàn)象 即 上皮 － 間質(zhì)轉(zhuǎn)換的細胞重編程機制進行探討；第五 課題 從腫瘤微環(huán)境的角度，探討腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞及細胞因子對腫瘤細胞生物學行為尤其是侵襲轉(zhuǎn)移的影響；第六 課題 整合所有的信息，描繪乳腺癌和肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。另外在腫瘤組織， CBX7 等 PcG 蛋白的正常組合關(guān)系被破壞，并且這種 PcG 蛋白組合紊亂與腫瘤相關(guān)基因失活之間可能存在因果關(guān)系?？傮w研究方案 如下 ： 課題 負責人： 朱衛(wèi)國，北京大學 學術(shù)骨干： 鄧大君，北京大學 伍會健， 大連理工大學生命 科學與技術(shù)學院 課題二： 組蛋白修飾異常在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 本課題將常規(guī)方法和高通量技術(shù)相結(jié)合，從篩選乳腺癌和肺癌中新的組蛋白修飾調(diào)控因子及其復合物出發(fā)，逐步揭示所獲得的候選基因?qū)τ诮M蛋白修飾的作用和調(diào)控機理，并進一步闡明這些基因在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機制?？傮w研究方案 如下 ： 腫瘤 DNA甲基化組和應(yīng)用研究 DNA甲基化形成機制研究 代表性腫瘤及非瘤組織標本收集 500例 腫瘤 DNA甲基化組測定啟動子芯片 基因功能分析生物信息學分析 確定腫瘤發(fā)生 /轉(zhuǎn)移 /侵襲相關(guān)的甲基化網(wǎng)絡(luò) 驗證研究：大樣本患者隨訪、 模式動物 建立腫瘤轉(zhuǎn)移能力的 DNA甲基化分型體系 RLGS/MeDIP/Promoter array等方法分析腫瘤基因組甲基化 譜式 分析腫瘤細胞中異常甲基化的啟動子區(qū)域組蛋白修飾的狀況ProfileProfile 篩選影響 DNMT和 DNA結(jié)合 及 組蛋白修飾的關(guān)鍵蛋白 探討關(guān)鍵蛋白活性和 自身修飾的變化 明晰特異基因發(fā)生 DNA甲基化 的分子機制和組蛋白修飾調(diào)控DNA甲基化的分子機制 探明關(guān)鍵蛋白與 DNMT和 DNA 結(jié)合蛋白相互作用的分子機制 課題 負責人 ： 葉棋濃，軍事醫(yī)學科 學院生物工程研究所 學術(shù)骨干： 楊曉，軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所 課題三： 非編碼 RNA 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 研究 ncRNA 作用機制的一個關(guān)鍵就是鑒定與之相互作用的靶分子，特別是蛋白分子。 組蛋白修飾異常機制與腫瘤發(fā)生發(fā)展 篩選新的組蛋白修飾復合物 /因子 甲基化酶、磷酸酶、 Smad4 和 ER 轉(zhuǎn)錄因子等 相互作用 分析 組蛋白修飾 分析 靶基因表達 分析 建立腫瘤發(fā)生 發(fā)展 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的組蛋白 修飾網(wǎng)絡(luò) 高通量芯片、酵母雙雜交、 免疫沉淀 質(zhì)譜 課題 負責人： 宋旭，四川大學 學術(shù)骨干： 宋爾衛(wèi)，中山 大學 李沁桐，四川大學 課題四：上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)換的機理及 惡性腫瘤 侵襲轉(zhuǎn)移的 細胞重編程機制 以乳腺癌細胞系、腫瘤組織及癌旁正常組織為模型，探討 EMT 的細胞重編程作用機理及其在乳腺癌轉(zhuǎn)移及化療藥物耐受中的作用。同時，選取兩種以上高轉(zhuǎn)移性細胞系，以 TGF?或 TNF?刺激細胞 或 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 ?catenin 分別激活TGF?、 NF?B 以及 Wnt 信號通路誘導 EMT。 總體研究方案如下： 課題 負責人： 尚永豐，北京大學醫(yī)學部 學術(shù)骨干： 梁靜，北京大學醫(yī)學部 張華， 中國航天員科研訓練中心 課題五：細胞微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移 以乳腺癌為模型，分別從腫瘤細胞微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)成纖維細胞、浸潤的免疫細胞（腫瘤相關(guān)性巨噬細胞）和基質(zhì)分子（細胞因子 TGFβ）入手，研究腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞生物學行為尤其 是 侵襲轉(zhuǎn)移的影響。為了更深入地研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還需要從以下幾個方面進一步發(fā)展基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)的因果推斷方法。為了保證學習結(jié)果的魯棒性，我們擬開發(fā)一系列能保持因果關(guān)系的特 征選擇方法來解決這個問題。為了通過實驗驗證貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型推測出來的因 果關(guān)系，我們將把它們作為遺傳學的上下游關(guān)系處理。實際上，一些已報 道的因果關(guān)系正是利用上述方法和遺傳突變在模式生物或細胞實驗中發(fā)現(xiàn)的。比較不同細胞系在 EMT 前后其基因表達譜變化， 用 MeDIPseq 法比較基因組范圍內(nèi) DNA 甲基化變化情況，并用 ChIPseq 法比較與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的主要的組蛋白修飾標志如激活性的組蛋白乙酰化、 H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9， H3K27， H4K20甲基化等在全基因組范圍內(nèi)的分布變化規(guī)律。 第 二 年 1） 分析圍繞甲基化基因啟動子周圍的組蛋白修飾狀況，開展核小體在 DNA 甲基化擴展過程中的 作用研究；開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化標志物多中心驗證研究； 2） 利用免疫共沉淀、 GST pulldown、細胞內(nèi)共定位等蛋白質(zhì)間相互作用技術(shù)驗證篩選獲