【正文】 A 的表達(dá)及其對線粒體相關(guān)基因、凋亡基因及毛細(xì)胞功能的影響。 （ 4） 研究安全、有效、便于臨床應(yīng)用的耳蝸局部給藥途徑。 2）研究老年性聾早期分子診斷技術(shù)：根據(jù)研究內(nèi)容 1）的研究結(jié)果，篩選老年性聾的易感基因，經(jīng)過臨床收集的老年性聾資料驗證，探索老年性聾的早期分子診斷技術(shù)及理論依據(jù)。 2）定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 （ 1） 將螺旋神經(jīng)元損傷的動物模型在干細(xì)胞移植后分為兩組，分別接受 60 dB和 90 dB SPL 白噪聲刺激，應(yīng)用聽力學(xué)技術(shù)檢測實驗動 物聽力恢復(fù)情況；采用熒光金標(biāo)記技術(shù)觀察分化神經(jīng)元軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)及纖維投射，用免疫組化和分子生物學(xué)技術(shù)檢測移植后信號分子及神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)情況，觀察移植細(xì)胞遷移及移植后細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例和表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)的情況，評估不同強(qiáng)度聲刺激對移植細(xì)胞分化、遷移的影響及其分子機(jī)制。 3）再生毛細(xì)胞功能鑒定：采用膜片鉗技術(shù)結(jié)合 FM143 熒光染色技術(shù)鑒定再生毛細(xì)胞的功能。 5. 在研究團(tuán)隊上，本項目由國內(nèi)在感音神經(jīng)性聾臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域成績突出、各有特色、密切相關(guān)，并且優(yōu)勢互補(bǔ)的優(yōu)秀團(tuán)隊組成。 3. 在工作基礎(chǔ)方面，我們在感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機(jī)制及生物學(xué)干預(yù)措施研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了一定成果，相關(guān)研究獲得國家科技進(jìn)步獎二等獎 2 項，高等院校自然科學(xué)獎一等獎一項；前期在遺傳、環(huán)境及老化等因素致 聾機(jī)制研究和生物學(xué)干預(yù)研究方面積累了豐富的經(jīng)驗，多次在國際頂級雜志發(fā)表論文。 5. 在實驗條件方面，本項目組擁有三個耳鼻喉科國家重點學(xué)科和一個全軍耳鼻喉科臨床中心；擁有衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學(xué)重點實驗室、衛(wèi)生部聽力篩查中心和分子醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，擁有儀器設(shè)備先進(jìn)齊全，并與國外多所知名大學(xué)包括哈佛大學(xué)眼耳醫(yī)院、麻省理工大學(xué)聯(lián)合 EPL聽覺中心、斯坦福大學(xué)聽覺實驗室及瑞士蘇黎世大學(xué)耳科中心等建立了長期的合作伙伴關(guān)系，可為本課題提供必要的物質(zhì)和技術(shù)支持。 為 建立規(guī)范化的遺傳性聾產(chǎn)前診斷和老年性聾早期分子診斷提供依據(jù)； 建立 35 個抗凋亡途徑保護(hù)毛細(xì)胞的新方法、新制品、新方案或新策略； 建立安全、有效的耳蝸基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，了解耳蝸植入干細(xì)胞分化狀況及毛細(xì)胞再生機(jī)制 發(fā)表 SCI 論文 510 篇 第四年 完成新發(fā)現(xiàn)耳聾基因功能及致聾機(jī)制鑒定；選定用于診斷策略的耳聾相關(guān)基因并研究其用于診斷的依據(jù)及可行性；研究耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護(hù)措 施，研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)糾正遺傳缺陷所致耳聾，研究毛細(xì)胞增殖分化和再生的機(jī)制，探索將干細(xì)胞移驗證早期分子診斷的價值 建立保護(hù)毛細(xì)胞免于致聾因素的損傷的技術(shù) 申請專利 24 項，發(fā)表 SCI 論文510 篇 植治療和基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)毛細(xì)胞再生的策略 第五年 進(jìn)行項目總結(jié)，分析總結(jié)實驗結(jié)果，評估新發(fā)現(xiàn)的感音神經(jīng)性聾發(fā)病相關(guān)基因 功能和致聾機(jī)制 ， 建立早期 診斷 技術(shù)的理論依據(jù)；評估生物學(xué)干預(yù)措施的新策略。 培養(yǎng)一批我國具有國際競爭力的優(yōu)秀聽覺醫(yī)學(xué)研究人才，預(yù)計培養(yǎng)國家杰出青年科學(xué)基金獲得者、教育部“長江學(xué)者特聘教授” 和中科院“百人計劃”入選人才共 35 名；教育部“新世紀(jì)人才計劃” 68 名。 2) 環(huán)境因素所致毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機(jī)制：研究噪聲、耳毒性藥物及感染等因素造成毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷的機(jī)制。 2. 耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷保護(hù)及干預(yù) （ 1）遺傳及老化因素所致耳蝸損傷的早期診斷 1) 遺傳性聾產(chǎn)前診斷規(guī)范研究：在我們建立的高通量耳聾基因篩查技術(shù)的基礎(chǔ)上，探索無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)，以母體外周血分離胎兒細(xì)胞及胎兒 DNA 富集為重點，建立無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術(shù)；結(jié)合產(chǎn)前診斷需求及基因篩查技術(shù)平臺，研究并建立規(guī)范性聾病產(chǎn)前診斷體系，對 其模式、效果進(jìn)行評估。針對 Connexin 基因突變和大前庭水管綜合征這二個我國最常見的遺傳性聾，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)干預(yù) Connexin 基因突變（ Cx30 和 Cx26 基因缺失突變小鼠模型）和大前庭水管綜合征小鼠模型（ SLC26A4 和 Foxi1 基因缺失突變）的實驗研究。擬在損傷耳蝸感覺上皮過量表達(dá) raf1 基因，短暫下調(diào) Rb 基因功能，促進(jìn) pRb 磷酸化，解除 Rb 對前體細(xì)胞增殖的抑制作用，激活耳蝸前體細(xì)胞增殖和毛細(xì)胞再生；或同時轉(zhuǎn)染激活前體細(xì)胞增殖和促毛細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因激活毛細(xì)胞再生，擬在損傷耳蝸感覺上皮轉(zhuǎn)染 ，以期過量表達(dá) pax2 促進(jìn)前體細(xì)胞增殖，同時增殖細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞關(guān)鍵的分化因子 math1，促使增殖細(xì)胞分化為毛細(xì)胞；研究再生毛細(xì)胞的功能及新生毛細(xì)胞對耳聾鼠模型聽覺功能修復(fù)狀況。 在病理性近視的致病基因和易感基因方面，項目綜合了家系連鎖分析，散發(fā)個體功能區(qū)域測序，大規(guī)模群體 GWAS 和模式生物表觀遺傳學(xué)分析，個體和群體水平兼顧，基因組和表觀基因組層面兼顧，不但在疾病相關(guān)基因定位研究的深度和廣度上具有絕對優(yōu)勢，更能確保最終發(fā)現(xiàn)和定位數(shù)個 病理性 近視的易感基因和位點。本項目申請團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn) 了 一些原創(chuàng)性 的 結(jié)果， 如已 首次在近視中發(fā)現(xiàn)了非編碼 RNA 的改變及基因的甲基化 改變 。項目依托由楊雄里院士領(lǐng)導(dǎo)的復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物實驗室，該實驗室長期從事視網(wǎng)膜信息加工及其機(jī)制的研究。 在 近視局部和中樞機(jī)制 研究方面， 將近視研究從傳統(tǒng)的主要以局部機(jī)制研究引入中樞機(jī)制研究，它的基礎(chǔ)是本項目具有 能針對不同對象、不同生理指標(biāo)進(jìn)行功能觀測的腦成像研究平臺。 本項目具有自主 知識產(chǎn)權(quán) 的檢測技術(shù) 還 包括一臺超高分辨率的頻域 OCT（軸向分辨率達(dá) 3181。 這套系統(tǒng)是目前全球唯一能在體無創(chuàng)檢測調(diào)節(jié)的技術(shù) 。研究對學(xué)齡期近視兒童 “干預(yù)介入 ”過程中和 “干預(yù)效果發(fā)生 ”后從眼表 眼底 視覺神經(jīng)系統(tǒng)的信息表達(dá)特點和變化規(guī)律，探索光學(xué)像質(zhì)或調(diào)節(jié)對近視的誘導(dǎo)或干預(yù)作用是否與視覺信息的認(rèn)知存在一定的關(guān)系， 并獲得眼局部或視覺中樞信息及加工處理對近視發(fā)生發(fā)展及其干預(yù)的影響機(jī)制和作用效率，探索近視發(fā)生發(fā)展及其干預(yù)過程中調(diào)控機(jī)制。 研究內(nèi)容： 1） 、多巴胺及其受體在屈光發(fā)育中的作用 2） 、近視誘導(dǎo)后多巴胺能無長突細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的改變 3） 、 多巴胺的含量改變在近視發(fā)生發(fā)展中的作用 4） 、 多巴胺能無長突細(xì)胞在近視的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制 5） 、 明確多巴胺 D1受體和 D2受體在近視發(fā)生發(fā)展中的作用 經(jīng)費(fèi)比例： 25% 承擔(dān)單位： 復(fù)旦大學(xué)、溫州醫(yī)學(xué)院 課題負(fù)責(zé)人： 瞿佳 學(xué)術(shù)骨干： 鐘詠梅 王中峰 陳捷光 蔣麗琴 課題 與近視發(fā)生相關(guān)的視覺信息加工與處理異常之鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)改變研究 預(yù)期目標(biāo)： 科學(xué)問題： 1） 鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的調(diào)控機(jī)制； 2）這些調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解從而控制眼軸的生長并出現(xiàn)近視； 3）鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的調(diào)控機(jī)制是否能解釋某些人類病理性近視的 發(fā)病機(jī)制。同時，本課題將在個體和群體遺傳學(xué)分析、海量序列數(shù)據(jù)分析、基因組多態(tài)分析、統(tǒng)計和數(shù)據(jù)庫建立等多方面培養(yǎng)出一批掌握高級基因組研究手段的人才，為我國相關(guān)研究提供人力支持。 6） 、篩選與病理性近視并發(fā)癥相關(guān)的易感基因，并進(jìn)行多臨床中心基地大規(guī)模人群隨訪，確定易感基因位點與病理性近視并發(fā)癥的相關(guān)性。 研究內(nèi)容： 1） 、 系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 近視 相關(guān)非編碼 RNA。 5） 、 研究新非編碼 RNA參與及影響與近視相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。 1）、 探討病理性近視動物模型 CNV 以及后鞏膜葡萄腫形成的過程與自然預(yù)后 。 經(jīng)費(fèi)比例： 12% 承擔(dān)單位： 廈門大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 劉祖國 學(xué)術(shù)骨干： 李煒 陳永雄 安建宏 各課題間相互關(guān)系 如圖 2，本項目所設(shè)置的 6 個課題相對獨立，但又互相交匯并緊密聯(lián)系。此外，視網(wǎng)膜和鞏膜上基因表達(dá)的改變，也可能和并發(fā)癥發(fā)生的機(jī)制相聯(lián)系（課題六）。 （ 5）近視的遺傳因素研究（課題四），其立論依據(jù)就是病理性近視是視覺信號傳遞處理加工過程中的相關(guān)基因的異常所致，因此篩選出的致病基因或易感基因，最后需要從基因表達(dá)（課題五）、視網(wǎng)膜 神經(jīng) 遞質(zhì)（課題二）、鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)（課題三）等方面進(jìn)一步研究其致病機(jī)制。 技術(shù)路線： 根據(jù)本項目學(xué)術(shù)思路，設(shè)計 六個方向 課題 進(jìn)行 深入研究 （ 如 圖 3 所示 ） ，課題將設(shè)置基因定位和易感基因篩選，模式動物和動物模型，群體和分子流行病學(xué)等研究基地或平臺。 我國是近視大國，本項目緊密結(jié)合我國該病的特點和豐富的遺傳和臨床資源，以及在某些點上已獲得的突破性進(jìn)展（見國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 和發(fā)展趨勢部分 ）和前期的預(yù)實驗結(jié)果 （見現(xiàn)有工作基礎(chǔ)和條件部分） ，通過繼續(xù)擴(kuò)大和深入研究，吸引相關(guān)領(lǐng)域 的人才參與，從不同學(xué)科出發(fā)，利用不同技術(shù)，從多個角度入手，從而將對近視的研究連成一片，有望在近視研究方面獲得突破 的進(jìn)展 ，課題設(shè)計具有高度可行性 。明確可能引起屈光發(fā)育異常的視覺因素。結(jié)合局部注射多巴胺 D1 受體和 D2受體的激動劑和拮抗劑或體內(nèi)注射 RNAi干預(yù)特定受體，了解多巴胺受體亞型對屈光發(fā)育和實驗性近視的影響。 建立和完善病理性近視并發(fā)癥的動物模型。 建立光學(xué)矯正、界面曲率改變、調(diào)節(jié)變化、藥物使用或眼保健操等干預(yù)措施的隨機(jī)對照試驗人群，闡明 光學(xué)像質(zhì)或調(diào)節(jié)與視覺信息認(rèn)知的關(guān)系 建立白化病豚鼠和多巴胺 D2 受體敲除小鼠近視模型。 通過全基因組 SNP 芯片對收集到的兩個大型高度 近視家系和兩個大型并發(fā) CNV家系進(jìn)行連鎖分析，確定候選區(qū)域。利用TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠建立近視動物模型。 病理性近視全基因組關(guān)聯(lián)分析及、重癥患者基因組功能區(qū)域測序 ，開始病理性近視候選基因 Ultra Deep Resequencin。建立TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠形覺剝奪近視模型，準(zhǔn)備進(jìn)一步進(jìn)行多巴胺無長突細(xì)胞功能、形態(tài)和活動的研究。闡明多巴胺及其受體系統(tǒng)異常與病理性近視并發(fā)癥的相關(guān)性。 建立體外培養(yǎng)鞏膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞系和鞏膜組織培養(yǎng)。利用細(xì)胞培養(yǎng)方法，研究多巴胺及其受體系統(tǒng)對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞遷移、管腔形成的影響 。明確近視進(jìn)展過程中多巴胺能無長突細(xì)胞功能以及電活動的改變。建立鞏膜和視網(wǎng)膜基因組遠(yuǎn)程調(diào)控序列圖譜；著手建立人群隨訪隊列，建立病例資料和收集血液樣本。 利用 TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠近視模型 運(yùn)用loosepatch clamp、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)以及鈣成像技術(shù)，研究形覺剝奪對多巴胺能無長突細(xì)胞神經(jīng)元之間信號通路、膜受體和離子通道的影響。 完成病理性近視的隊列建設(shè) 。 在體和離體水平上闡明病理性近視基因?qū)η獾挠绊憽? 一、研究內(nèi)容 本項目將緊緊圍繞 “視覺信息加工與處理，視網(wǎng)膜到鞏膜的信號級聯(lián)和傳遞 ”這一近視形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和科學(xué)問題，在環(huán)境、基因及其相互作用，在眼球視網(wǎng)膜、鞏膜 乃至視覺中樞 的作用及其相互聯(lián)系，在臨床表現(xiàn)和干預(yù)等 數(shù) 個相互獨立而又密切聯(lián)系的層面上開展深入研