【正文】 3． 胃癌前病變過(guò)程中用于診斷和預(yù)警的關(guān)鍵異常分子標(biāo)志物 在胃癌前病變過(guò)程中，關(guān)鍵分子事件的出現(xiàn)對(duì)惡性表型的發(fā)生至關(guān)重要。 第五 年 1. 進(jìn)一步整合來(lái)自白血病基因組數(shù)據(jù)（包括突變、結(jié)構(gòu)異常、拷貝數(shù)變化等）、表觀遺傳組數(shù)據(jù)（ DNA 甲基化）、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（包括編碼蛋白基因和小 RNA）以及相關(guān)功能研究 數(shù)據(jù)，完善生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及數(shù)學(xué)模型，提出基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)的白血病發(fā)生發(fā)展理論； 2. 整合來(lái)自藥物處理后白血病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)，總結(jié)有效藥物對(duì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及數(shù)學(xué)模型變化的影響，提出基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)的白血病靶向治療初步理論； 3. 新型藥物或治療方案擴(kuò)大臨床應(yīng)用，對(duì)臨床治療效果有初步評(píng)價(jià)；進(jìn)一步評(píng)估新型診斷指標(biāo)指導(dǎo)臨床方案的價(jià)值； 4. 在國(guó)內(nèi)外一流學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 710 篇，申請(qǐng)專利 35 項(xiàng)。 本項(xiàng)目首次將系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論和技術(shù)聚焦于白血病研究，作為腫瘤研究的良好模型，白血病有其獨(dú)特性，必將對(duì)系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)理論和技術(shù)提出新的要求，通過(guò)本項(xiàng)目也必將豐富這些理論和技術(shù)，為實(shí)體瘤及其他復(fù)雜性狀疾病研究提供可借鑒的經(jīng)驗(yàn)以及較完善的技術(shù)平臺(tái)和理論指導(dǎo)。 33 三、研究方案 1）總體思路： 白血病是一種造血干 /祖細(xì)胞惡性增值并伴有分化受阻的惡性疾病。 、新模型和新理論研究 :系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)為一新興學(xué)科，亟需發(fā)展相關(guān)新技術(shù)、新模型和新理論并應(yīng)用于包括白血病在內(nèi)的復(fù)雜性狀疾病研究。 2. 闡明 Th17 及其相關(guān)炎癥因子、 Wnt/DKK1 介導(dǎo) RA 滑膜炎癥與骨質(zhì)破壞的免疫損傷機(jī)理，發(fā)現(xiàn)新的關(guān)鍵 靶分子。 7. 對(duì)以上發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因、 RA 關(guān)聯(lián) CNP、 RA 特征性小分子及 RA 差異表達(dá)基因在早期 RA 患者血液中表達(dá)進(jìn)行研究。 17. 明確抗 Cyr61 抗體能夠阻斷該分子的致病作用，爭(zhēng)取發(fā)現(xiàn) 1－ 2 個(gè)關(guān)鍵作用表位。 8. 闡明 RA 相關(guān)小分子調(diào)控免疫功能的機(jī)制研究。 21. 具有體內(nèi)中和作用的抗 Cyr61 抗體表位分析。 13. 分析 Treg 數(shù)量與 RA 患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性。 6. 檢測(cè) RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中 Vγ1 和 Vγ4 的數(shù)量和功能。 15． 闡明 OPGHSP 重組蛋白防治骨破壞和炎癥反應(yīng)的機(jī)制。 7． 分析出不同亞群 Treg 對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用。 19． 探討 RANKL TNF 多肽疫苗發(fā)揮保護(hù)性效果的作 用機(jī)制。 12． 采用基因表達(dá)芯片比較上調(diào)或下調(diào) 小分子 表達(dá)后， 其在 相應(yīng)免疫細(xì)胞表達(dá)譜的差異，尋找差異表達(dá)的 RA 相關(guān)小分子 。 4． 研究 RA患者血清中針對(duì) RAT細(xì)胞的調(diào)節(jié)性抗體的滴度與抗原特異性。 12． 力爭(zhēng)獲得 12個(gè)經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾而提高體內(nèi)穩(wěn)定性及特異性的針對(duì) RA相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)的 siRNA。 4． 明確 Th17 等細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子對(duì)于 RA 滑膜炎癥的作用與調(diào)控機(jī)制。 15． 進(jìn)行 首批 HDACi 分子的生物學(xué)測(cè)試。 22 7． 明確炎癥因子 IL17 和相關(guān)炎癥因子對(duì) Cyr61 表達(dá) 的影響和參與滑膜細(xì)胞過(guò)度增生的作用。 12． 爭(zhēng)取獲得人源化抗 Cyr61 抗體表 達(dá)克隆及穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。 4． 明確不同 Treg 亞群對(duì) CIA 發(fā)病的不同調(diào)控作用。 16． HDAC 同功酶的結(jié)構(gòu)計(jì)算；合成首批分子。 9． 分析 RA 患者 FLS 中 Wnt/DKK 表達(dá)格局。 經(jīng)費(fèi)比例： 20% 承擔(dān)單位： 首都醫(yī)科大學(xué)、南開(kāi)大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 趙文明 學(xué)術(shù)骨干： 王鵬、王璞 玥 、李慎濤、沈杰、趙煒、王 煒 20 四、年度計(jì)劃 第一年度 （一）研究?jī)?nèi)容 1． 篩選 RA 特異的相關(guān)抗原和表位，并制備相應(yīng)的特異性抗體。 3） HLADRB1 特異性變構(gòu)肽對(duì) CIA 模型的抑制作用。本課題是在這一主旨上進(jìn)行的臨床轉(zhuǎn)化研究。 2. 間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì) RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究 1） MSCs 對(duì) RA 患者 T 細(xì)胞功能的影響。這些原創(chuàng)性研究必將使 RA 免疫調(diào)控的新分子機(jī)制得到認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步的免疫干預(yù)提供新型介入靶點(diǎn)。 4）利用抗 T細(xì)胞抗體分析活化態(tài) T細(xì)胞表面參與免疫應(yīng)答調(diào)控的重要分子。 4. RA 相關(guān)抗原的糖基化修飾研究 1) 糖基化抗原的合成。 本課題的主要研究?jī)?nèi)容如下： 1. 前期組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的新 RA 自身抗原結(jié)構(gòu)和 功能研究 1）新型 RA 相關(guān)抗原的表位分析 。而且，課題組成員已在上述各領(lǐng)域進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究，不少成員間有多年的合作研究基礎(chǔ)和成果。 3. 高起點(diǎn)的新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)： 本項(xiàng)目利用我們獨(dú)有的一系列轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型進(jìn)行RA 新的調(diào)控分子在動(dòng)物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制研究，實(shí)驗(yàn)涉及本課題組建立的IL33 轉(zhuǎn)基因鼠、 FOXP3/IL10 報(bào)告轉(zhuǎn)基因鼠、 RA 易感 HLADRB1*0405 轉(zhuǎn)基因鼠等，這些動(dòng)物模型均為本團(tuán)隊(duì)自建或合作構(gòu)建，為本團(tuán)隊(duì)獨(dú)有，利用這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，將對(duì)闡述常規(guī)實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行研究的新機(jī)制具有重要作用。 2）團(tuán)隊(duì)包括了多名長(zhǎng)江學(xué)者、跨世紀(jì)優(yōu)秀人才、國(guó)家杰出青年、百人計(jì)劃、北京市科技新星等優(yōu)秀科研人才，長(zhǎng)期從事 RA 臨床和基礎(chǔ)研究，并具備實(shí)施大型科研項(xiàng)目的能力。自身抗原的識(shí)別和結(jié)合是 RA 發(fā)病的啟動(dòng)階段，尋找新的 特異性自身抗原及翻譯后修飾的致病機(jī)制 研究是解釋 RA 發(fā)病機(jī)制的根本途徑。 10. 探討 RA 特異性生物標(biāo)志分子用于臨床診斷靶標(biāo)的意義。 2. 對(duì)項(xiàng)目組前 期工作發(fā)現(xiàn)的一系列 RA 自身抗原，利用項(xiàng)目組成熟的表位功能研究和抗原修飾平臺(tái)，這些新抗原的致病機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，在此基礎(chǔ)上探索其臨床應(yīng)用價(jià)值。上述新型免疫負(fù)調(diào)控機(jī)制的深入研究將為 RA 免疫干預(yù)策略提供新的靶向。 本項(xiàng)目將緊密圍繞這一關(guān)鍵問(wèn)題，從 RA 自身抗原鑒定和特征性修飾特征、 RA 特異性自身免疫反應(yīng)及負(fù)調(diào)控機(jī)制、滑膜炎癥和骨破壞的新分子機(jī)制以及免疫遺傳學(xué)等方面對(duì) RA 發(fā)病的免 疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，并在此基礎(chǔ)上，尋找創(chuàng)新性及特異性的 RA 早期診斷和免疫干預(yù)的新方法。本項(xiàng)目組前期對(duì)上述負(fù)調(diào)控機(jī)制在 RA 中的3 作用進(jìn)行了大量研究。 上述 主要研究?jī)?nèi)容緊緊圍繞關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題， 從 RA 的自身免疫應(yīng)答啟動(dòng)、異常免疫應(yīng)答及炎癥和組織破壞等不同階段深入探討 RA 發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，并對(duì)RA 臨床診斷新靶標(biāo)和免疫干預(yù)新方法進(jìn)行研究，是各課題密切關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)性的基礎(chǔ)和臨床基礎(chǔ)研究工作，基礎(chǔ)與臨床有機(jī)結(jié)合，有望全面系統(tǒng)地闡述 RA 發(fā)病各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵性分子，并使我國(guó) RA 的創(chuàng)新性研究達(dá)到國(guó)際前沿水平。 7. 探討間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì) RA 免疫負(fù)調(diào)控中的作用機(jī)制，探索新的 RA 免疫干預(yù)策略 。 6 三、研究方案 (一 )總體研究思路： RA 是一種復(fù)雜性狀疾病，多種關(guān)鍵性因素在 RA 發(fā)病過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，因此，必須從 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，才能使其發(fā)病機(jī)制得到充分認(rèn)識(shí)。以上 6 個(gè)方面的技術(shù)路線如下： RA 相關(guān)新型自身抗原鑒定及修飾特點(diǎn)研究 隨機(jī)肽庫(kù) RA 模擬肽 信息學(xué) 分析 免疫共沉淀 天然抗原 RA 新抗原 糖芯片檢測(cè) 合成糖基化修飾蛋白 單抗免疫親和層析結(jié)合液質(zhì)聯(lián) 用鑒定新 修飾 抗原 已知修飾 抗原 表位分析 BIAOWIE HLADRB1 分子結(jié)合 能力 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞株 RA 患者 T 細(xì)胞 新抗原誘導(dǎo)鼠關(guān)節(jié)炎模型 已完成 前期組學(xué)研究 蛋白質(zhì)組 滑膜 cDNA 文庫(kù) 8 RA 的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 抗原 T 表位 表位改造 Mimogen 表位數(shù)據(jù)庫(kù) 免疫信息學(xué)分析 In Silico 實(shí)驗(yàn) /預(yù)測(cè) 遞送系統(tǒng) 免疫應(yīng)答特征 作用機(jī)理 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞 糖表位 TCR特性 活化相關(guān)膜分子 T 細(xì)胞活化功能 T 細(xì)胞亞型 亞型分布 RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞 流式 1. 應(yīng)用抗 亞型特異性 抗體清除 小 鼠 γ δ T 細(xì)胞亞群 2. 分離 Vγ1和 Vγ4 γδ T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 膠原性關(guān)節(jié)炎 小鼠 新靶向在 膠原性關(guān)節(jié)炎中的治療實(shí)驗(yàn) 對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎的影響 分選 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 闡明 γδT 細(xì)胞亞型在 RA 中的作用 9 RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制： RA 細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控機(jī)理研究： 已完成 間充質(zhì)干細(xì)胞 RA 相關(guān) 小分子 上調(diào)或下調(diào) RA 患者 外周血不同 細(xì)胞 亞群中小分子 表達(dá) CIA Treg 亞群 關(guān)節(jié)炎評(píng)分 關(guān)節(jié)病理 X 線評(píng)分 新生 兒 臍帶 血 RA 患者 T 細(xì)胞功能 致炎性 細(xì)胞因子 分泌 T 細(xì)胞增殖 細(xì)胞活化 及分化功能變化 細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化 增殖與凋亡 T 細(xì)胞表面功能蛋白表達(dá) 外周血不同細(xì)胞亞群中上述小分子水平的變化 差異表達(dá)芯片 小分子作用 靶 點(diǎn) 芯片鑒定 RA 患者 PBMC 中小分子表達(dá)譜 靜脈注射 不同亞型分布 亞型分選 不同亞型 Treg 對(duì)致病性 T 細(xì)胞的抑制功能 Fexp3/IL10 Tg 誘導(dǎo) CIA CIA 靜脈注射 滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng) 炎癥細(xì)胞體外培養(yǎng)（ Th17/Th1） 滑膜細(xì)胞與 Th17/Th1共培養(yǎng) 對(duì)滑膜細(xì)胞增殖功能的影響 對(duì)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的影響 對(duì) 滑膜細(xì)胞產(chǎn)生骨破壞介質(zhì) 的影響 骨破壞相關(guān)信號(hào)通路變化 靜脈注射 給CIA 小鼠 觀察 對(duì) 骨破壞、炎 性因子分泌及滑膜增生的影響 IL17 下游轉(zhuǎn)錄分子與途徑鑒定 IL6/IL8 基因敲除小鼠驗(yàn)證IL6/IL8 在 IL17通路中作用 Th17 RA 滑膜炎癥和損傷作用與調(diào)控途徑 合成靶向 DKK1 基因的 siRNA 去 IL17 血清過(guò)繼轉(zhuǎn)移，觀察CIA 發(fā)病率 10 RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究： RA 干預(yù)新策略的研究： 免疫啟動(dòng)環(huán)節(jié) 免疫調(diào)控環(huán)節(jié) 炎癥環(huán)節(jié) 骨破壞環(huán)節(jié) RA 相關(guān)炎癥靶點(diǎn) OPGHSP 重組蛋白 RANKL TNF 樣區(qū)疫苗 人源化抗 CYR61 單抗 以 CIA 鼠模型為平臺(tái) 機(jī)制研究 療效評(píng)價(jià) HLADRB1 特異性變構(gòu)肽 HDACi 同工酶 RA 特異性血清標(biāo)志分子 大樣本 RA患者中的驗(yàn)證 基因芯片掃描 利用多種分子生物學(xué)技術(shù)研究新 RA易感基因的致病機(jī)制 EXONCAPTURE 高通量 Solexa 分析 國(guó)外報(bào) 道的RA相關(guān) SNP 新 RA相關(guān)SNP 鑒定得到的 CNP基因 全基因組 CGH芯片篩選 CNP基因 (已完成 ) 蛋白組學(xué)鑒定 臨床診斷靶標(biāo)的應(yīng)用研究 RA易感基因 高通量Solexa 分析 高通量Solexa 分析 RA 差異 miRNA 譜 11 （三）可行性分析： 1. 前期工作基礎(chǔ) ： 1）團(tuán)隊(duì)內(nèi)前期取得了大量研究成果，本項(xiàng)目是對(duì)這些原創(chuàng)性研究的進(jìn)一步深入和轉(zhuǎn)化，保證了項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)和研究方案的可行性。 3）具備免疫干預(yù)方法評(píng)價(jià)的一系列特有的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。在 RA 的基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化、創(chuàng)新性理論等方面達(dá)到國(guó)際一流水平。 2. 建立新抗原的化學(xué)和酶學(xué)修飾平臺(tái)，闡明翻譯后修飾在 RA 發(fā)病中的作用。 2）修飾抗原在 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞激活中的作用。 本課題的主要研究?jī)?nèi)容如下： 15 1. 特異性自身反應(yīng)性 T細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子機(jī)制研究 1） RA自身反應(yīng)性 T細(xì)胞 免疫生物學(xué)特性 分析。 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 北京大學(xué)、中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 高曉明 學(xué)術(shù)骨干： 吳玉章、徐曉軍、牟芝蓉、呂平、孫曉麟、劉霞 課題 RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制 預(yù)期目標(biāo)： 系統(tǒng)闡明 RA 滑膜炎癥和骨破壞的發(fā)生機(jī)制和調(diào)控通路，為進(jìn)一步發(fā)展臨床早期防治 RA 骨質(zhì)疏松和骨破壞的臨床新策略 提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容： RA 自身免疫應(yīng)答過(guò)程除 了 MHC肽 TCR 誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞活化反應(yīng)外，還受細(xì)胞因子、小分子及調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞等因素的負(fù)調(diào)控影響，本項(xiàng)目通過(guò)對(duì)調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及小分子的免