【正文】 利用基因組學(xué)、群體遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的最新策略手段，在全基因組水平上從家系連鎖分析和候選區(qū)域重測序，重癥散發(fā)樣本的外顯子和調(diào)控區(qū)域 重測序，大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)分析和驗證，模式動物的轉(zhuǎn)錄組和甲基化分析以及人眼鞏膜細胞系的遠程調(diào)控元件分析等不同層面，多角度地定位和驗證若干具有代表性的病理性近視易感基因，并發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致發(fā)病的功能性突變或多態(tài)位點。 5） 、通過 ChIAPET 和 RNAi 等策略針對連鎖和關(guān)聯(lián)分析獲得的非編碼或遠程區(qū)域進行功能研究初步確定致病分子機制。 研究目標： 發(fā)現(xiàn)并鑒定與近視相關(guān)的非編碼 RNA； 闡明 DNA 甲基化與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機制對非編碼 RNA 的 調(diào)節(jié)作用； 闡明 近視相關(guān)的非編碼 RNA的功能。 4） 、 篩選并鑒定與近視相關(guān)特異性 ncRNA 相互作用的蛋白質(zhì) 。 研究內(nèi)容： 本課題擬利用病理性近視動物模型，探討病理性近視視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的血管性異常以及鞏膜細胞外基質(zhì)的異常，以探明病理性近視最常見的并發(fā)癥 脈絡(luò)膜新生血管（ CNV）以及后鞏膜葡萄腫的發(fā)病機制，探索視覺信息傳遞的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)通路在鞏膜和視網(wǎng)膜病變之間交流的存在和相互間關(guān)系，以此研究病理性近視并發(fā)癥的發(fā)生機制，同時探討通過信息傳遞的干預(yù)達到延緩或治療并發(fā)癥的可能性。 4）、 探討針對病理性近視 CNV 及鞏膜葡萄腫的新的預(yù)防和干預(yù)措施 。 （ 2）（課題五）研究的視網(wǎng)膜基因表達的改變研究，其結(jié)果可以和視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)的改變及相關(guān)的功能改變（課題二）相關(guān)聯(lián)，（課題五）研究的鞏膜上的基因表達的改變又和鞏膜細胞外基質(zhì)的合成降解機制（課題四）相關(guān)聯(lián)。 （ 4）鞏膜改變（課題三）導(dǎo)致眼軸過度拉伸，是出現(xiàn)并發(fā)癥（課題六）的一個關(guān)鍵因素，除了機械的拉升作用，還可能存在生物學(xué)的作用。 圖 3：課題的立項依據(jù) 四、 實現(xiàn)項目五年預(yù)期目標的總體研究思路和項目研究的技術(shù)路線及可行性。 可行性分析： 上述總體研究方案和技術(shù)路線組合我國在相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)具有國際領(lǐng)先水平的團隊和研究平臺進行聯(lián)合攻關(guān)，充分利用參與單位的良好基礎(chǔ)與力量，突出了各課題組的研究特色和優(yōu)勢 ，在研究實力上具有研究成功的可 信性 。 同時檢測多巴胺合成降解關(guān)鍵酶、多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白等，形態(tài)學(xué)觀察多巴胺能無長突細胞的改變 、 并研究白化病豚鼠（多巴胺合成障礙）和多巴胺 D2 受體敲除小鼠的屈光發(fā)育過程 、 鞏膜細胞外基質(zhì) 的改變、并 觀察病理性近視時脈絡(luò)膜新生血管 和后鞏膜葡萄腫 的形成過程與自然預(yù)后 病理性近視家系樣本手收集并關(guān)聯(lián)分析，模式動物甲基化譜和表達譜分析 系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定與近視相關(guān)的非編碼RNA 建立一個具有足夠樣本并且穩(wěn)定的我國學(xué)齡期兒童近視研究隊列，初步搜集影響我國學(xué)齡期兒童近視 發(fā)生發(fā)展 的各種環(huán)境因素 建立一系列多巴胺相關(guān)的近視動物模型。完成豚鼠誘導(dǎo)近視模型和小鼠誘導(dǎo)近視模型鞏膜組織的轉(zhuǎn)錄組測序和甲基化測序，確定導(dǎo)致近視發(fā)生的轉(zhuǎn)錄組變化和甲基化變化 系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并獲得與近視相關(guān)的非編碼RNA分子和信息 建立穩(wěn)定的病理性近視 CNV 動物模型；系統(tǒng)認識病理性近視 CNV 和后鞏膜葡萄腫的發(fā)生發(fā)展過程； 研究內(nèi)容 預(yù)期目標 第 二 年 學(xué)齡期兒童近視干預(yù)措施的有效性， 近視發(fā)生發(fā)展的信息調(diào)控途徑和調(diào)控機制 通過對白化病豚鼠和多巴胺 D2 受體敲除小鼠進行形覺剝奪和鏡片誘導(dǎo)，觀察多巴胺代謝等和受體異常對實驗性近視的影響 。并研究細胞外基質(zhì)基因表達調(diào)控及可能的藥物干預(yù)機制 。 研究 DNA 甲基化與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控 機制對近視相關(guān)非編碼 RNA 的調(diào)節(jié)作用 。引進 TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠并繁殖 明確鞏膜細胞外基質(zhì)改變對屈光的影響；尋找影響基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族、膠原基因家族的轉(zhuǎn)錄因子及藥物。利用多巴胺合成減少的白化豚鼠、 D2 基因敲除小鼠，結(jié)合局部注射多巴胺 D1 受體和D2 受體的激動劑和拮抗劑或體內(nèi)注射RNAi 干預(yù)特定受體，了解多巴胺受體亞型對屈光發(fā)育和實驗性近視的影響。采用體外細胞培養(yǎng)方法，探討多巴胺對鞏膜基質(zhì)細胞細胞外基質(zhì)代謝的影響。闡明多巴胺 D1和 D2 受體與近視發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 闡明近視相關(guān)非編碼 RNA 對鞏膜成纖維細胞生物學(xué)性狀的影響 闡明多巴胺及其受體系統(tǒng)在正常眼以及病理性近視眼球組織中的表達。并探討各種多巴胺藥物對近視模型的作用，研究藥物干預(yù)近視的可能 。 探討多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)對脈絡(luò)膜中血管抑制因子及血管生成因子平衡的調(diào)節(jié)作用。 初步分析各種近視干預(yù)方法的異同及其機制， 獲得眼局部 和 視覺中樞 的 信息加工處理對近視的影響機制 和作用效率 明確近視進展過程中多巴胺能無長突細胞的形態(tài)在細胞和亞細胞水平上的改變。 完成 500： 500 的高度近視樣本的候選基因區(qū)域重測序，確定致病突變和突變組合。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標 第 五 年 分析我國學(xué)齡期兒童近視的動態(tài)發(fā)病率、視相關(guān)的危險因素和保護因素，獲得學(xué)齡期兒童近視干預(yù)措施的有效性及其機制 。探討外源性應(yīng)用多巴胺或多巴胺受體拮抗劑等對病理性近視并發(fā)癥的干預(yù)研究。明確多巴胺無長突細胞傳遞視覺神經(jīng)信號的通路。 闡明近視相關(guān)非編碼 RNA 參與及影響的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路 初步闡明外源性應(yīng)用多巴胺或多巴胺受體拮抗劑對病理性近視并發(fā)癥的預(yù)防和治療作用。 。 為闡明和解決近視發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵科學(xué)問題，申請者 提出：首先從紛繁復(fù)雜的視覺線索中篩選出和影響眼球發(fā)育、包括近視發(fā)生相關(guān)的視覺刺激和其它的環(huán)境因素，以及與之相關(guān)聯(lián)的遺傳因素；其次，探索相關(guān)環(huán)境因素（特別是視覺刺激）以及遺傳因素是如何影響視覺信號傳遞及加工通路， 視覺信息加工與處理 異常如何引發(fā) 視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)和鞏膜生化的改變 及其途徑和機制 ，以及兩者是如何相互作用 的機制；進而對環(huán)境和遺傳因素是如何 進一步引起鞏膜細胞外基質(zhì)以及纖維形態(tài)的改變從而導(dǎo)致了近視的發(fā)生，以及在該途徑中視網(wǎng)膜和鞏膜的基因表達和調(diào)控機制進行深入的研究；再者，對這些環(huán)境和遺傳因素是否通過中樞途徑對 視覺信號通路和加工產(chǎn)生影響，如經(jīng)過視網(wǎng)膜的模糊適應(yīng)和調(diào)節(jié)等機制對眼球的發(fā)育進行中樞調(diào)控及機制進行探索性研究；此外，對于病理性近視，除了從上述兩個方面入手外，還需要深入研究視覺信號通路和加工異常對視網(wǎng)膜本身的影響以及其對鞏膜的進一步改變，最終又是如何逆向影響到視網(wǎng)膜等部位，從而產(chǎn)生視網(wǎng)膜等部位的并發(fā)癥。在細胞水平上闡明某些人類病理性近視的發(fā)病機制。 研究近視相關(guān)非編碼 RNA 參與及影響的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路 。研究病理性近視基因相關(guān)的轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠的屈光發(fā)育情況。 闡明與近視相關(guān)非編碼 RNA 相互作用的蛋白質(zhì) 闡明多巴胺對血管抑制因子 /血管生成因子平衡的調(diào)控作用。闡明多巴胺延緩近視進展的可能 在細胞水平上闡明鞏膜細胞外基質(zhì)合成和降解的調(diào)控機制及細胞信號通路。 病理性近視 候 選 基 因 Ultra Deep Resequencing，相關(guān)細胞 ChIAPET 測序，并建立隨訪隊列 。利用系統(tǒng)生物學(xué)、基因功能等技術(shù)，研究膠原 I， II，和V及 MMP 等合成調(diào)控機制，從細胞信號傳遞通路的機制上來進一步闡明在體的實驗結(jié)果。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標 第 四 年 學(xué)齡期兒童近視干預(yù)措施的機制， 近視發(fā)生發(fā)展的信息調(diào)控途徑和調(diào)控機制 通過細胞形態(tài)學(xué)研究，明確近視誘導(dǎo)后實驗動物視網(wǎng)膜多巴胺能無長突細胞的形態(tài)學(xué)（細胞和亞細胞水平）改變。 明確鞏膜細胞外基質(zhì)合成和降解相關(guān)的基因?qū)η獍l(fā)育的影響。 研究近視相關(guān)非編碼 RNA 對近視相關(guān)細胞生物學(xué)性狀的影響 。研究基因敲除小鼠鞏膜細胞外基質(zhì)的合成及降解及其機制。設(shè)計序列捕獲探針，對候選區(qū)域進行重測序，確定致病突變。進一步明確多巴胺減少和多巴胺受體亞型在近視發(fā)生發(fā)展中的作用。觀察正常動物及近視眼動物 CNV 形成過程的異同，以探討近視眼動物對新生血管誘導(dǎo)因素的易感性。引進TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠 。初步探索多巴胺代謝在近視發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，通過了解白化病豚鼠和D2 敲除小鼠的屈光發(fā)育，明確多巴胺減少和 D2 受體對屈光發(fā)育的影響。人員結(jié)構(gòu)合理、配置精煉，相關(guān)技術(shù)已經(jīng)掌握，實驗設(shè)備和條件均已具備，課題完全具備實施可行性。各平臺和研究課題相互獨立又緊密聯(lián)系。 圖 2：各課題組之間的關(guān)聯(lián) 及技術(shù)途徑 與項目總體目標和五年目標的關(guān)系 ： 本項目 將緊緊圍繞“ 視覺信號處理傳遞和加工異常 如何 導(dǎo)致近視 ” 這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)和科學(xué)問題 進行研究 （圖 3） ， 從視覺信號處理傳遞和加工相關(guān)的 環(huán)境、基因及其相互作用，在視覺中樞、眼球視網(wǎng)膜、鞏膜上的作用及其相互聯(lián)系，在臨床表現(xiàn)和干預(yù)等方面既相互獨立而又密切聯(lián)系的層面上 探索相關(guān)環(huán)境因素（特別是視覺刺激）是如何影響在視網(wǎng)膜上導(dǎo)致視覺信號傳遞及加工通路異常，從而引起鞏膜細胞外基質(zhì)以及纖維形態(tài)的改變，最終導(dǎo)致了近視產(chǎn)生的 ，以及該途徑中視網(wǎng)膜和鞏膜的基因表達和調(diào)控；探索 這 些環(huán)境和遺傳因素是否通過中樞途徑，經(jīng)過視網(wǎng)膜的模糊適應(yīng)和調(diào)節(jié)等機制對眼球的發(fā)育進行中樞調(diào)控；另一方面，對于病理性近視，進一步研究視覺信號通路異常是如何對視網(wǎng)膜本身 產(chǎn)生 影響、繼而 引起鞏膜改變，最終又逆向影響到視網(wǎng)膜等部位 產(chǎn)生 并發(fā)癥。 （ 3）視網(wǎng)膜 神經(jīng) 遞質(zhì)的改變（課題二）是研究近視發(fā)生的視網(wǎng)膜信號傳遞和加工的變化，異常視網(wǎng)膜信號傳遞到鞏膜，產(chǎn)生鞏膜上的改變（課題三）。 （ 1）（課題一）近視相關(guān)環(huán)境因素研究過程和實施的主要目的是篩選出與近視發(fā)生相關(guān)的環(huán)境因素，而這些環(huán)境因素作用于視網(wǎng)膜上引起視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)的改變（課題二）；進而產(chǎn)生鞏膜細胞外基質(zhì)的改變（課題三），同時也出現(xiàn)視網(wǎng)膜及鞏膜上基因表達的調(diào)控改變（課題五），最后導(dǎo)致近視，一部分病例由于上述視網(wǎng)膜、鞏膜的改變還引進發(fā)癥的出現(xiàn)（課題六） 。 2）、 探討病理性近視動物模型 CNV 以及后鞏膜葡萄腫發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)機制 。 經(jīng)費比例： 13% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院動物研究所、溫州醫(yī)學(xué)院 課題負責(zé)人： 何順民 學(xué)術(shù)骨干： 屠理理 閆東升 陳曉燕 王麗花 課題 視覺信號處理、傳遞異常導(dǎo)致的近視并發(fā)癥機制及干預(yù)基礎(chǔ)研究 預(yù)期目標： 科學(xué)問題： 在 高度近視患者中部分患者伴隨進行性的眼軸過度延長，眼球壁的膠原纖維發(fā)生病理性改變，鞏膜、脈絡(luò)膜以及視網(wǎng)膜發(fā)生退行性變化，繼而產(chǎn)生諸多并發(fā)癥，嚴重時可以致盲。 2） 、 研究 DNA甲基化與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機制對新非編碼 RNA的調(diào)節(jié)