【正文】 上表說明 A和 B能夠利用硫酸按、酵母膏、硝酸按、蛋白胨和硝酸鉀作為唯一氮源 。C 能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖為唯一碳源 ,不能利用 DL甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸。所以我們將 A、 B和 C接種到這種特定的含各種不同氮源的碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基上后 ,各培養(yǎng)基中菌株的生長情況如下表所示 : 14 唯一碳源實(shí)驗(yàn)結(jié)果 菌種編號 葡萄糖 乙醇 蔗糖 DL甲硫氨基酸 檸檬酸 草酸 A +++ +++ ++ + + + B +++ +++ +++ ++ — — C ++ + ++ — — — 上表說明 A 能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、 DL甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸作為唯一碳源 。無莢膜 ,無芽孢。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長 ,這表明 C 為兼性厭氧菌。無莢膜 ,無芽孢。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長 ,這表明 B 為兼性厭氧菌。無莢膜 ,無芽孢。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長 ,這表明 A 為兼性厭氧菌。 菌種的復(fù)篩與分離純化達(dá)到目標(biāo)濃度后 ,取一環(huán)菌懸液按稀釋、平板分離法進(jìn)行操作 ,待菌株生長后 ,選取長勢最好 ,且形態(tài)穩(wěn)定相似的菌落按三平板劃線分離法進(jìn)一步分離純化 ,最后在馴化培養(yǎng)基一中獲得 3 株菌株 ,對它們進(jìn)行編號分別為 :A、 B 和 C,接種至斜面并保存于冰箱中 ,以備進(jìn)一步的馴化以及后續(xù)試驗(yàn)使用。取培養(yǎng)后的該培養(yǎng)液 5mL 再接種馴化培養(yǎng)基中 ,紅霉素濃度為 13 200mg/L,在上述條件繼續(xù)下培養(yǎng)。 紅霉素產(chǎn)生菌的篩選和鑒定 將含有所要篩選的微生物的污泥按搖瓶培養(yǎng)的步驟操作 ,分別往 50ml 普通培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 5ml 活性污泥 33℃厭氧條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。 5 號菌株即為正交實(shí)驗(yàn)所得到的最優(yōu)結(jié)果 （ 4） 小結(jié)： 正交實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)次數(shù)太多，費(fèi)時、費(fèi)事； 不做重復(fù)實(shí)驗(yàn)就無法估計誤差； 無法區(qū)分因素的主次； 正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)： 試驗(yàn)點(diǎn)代表性強(qiáng)，試驗(yàn)次數(shù)少； 不需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，就可以估計實(shí)驗(yàn)誤差； 可以分清因素的主次； 可以使用數(shù)理統(tǒng)計的方法處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出好的條件； 12 試驗(yàn)號 A B C D 生物效價（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 因素主次： DBAC 最優(yōu)方案 : A2B2C3D1 菌種的初篩與馴化 如果通過自然篩選獲得高效菌種需要較長的時間，所以通過人工富集培養(yǎng)分離，篩選出降解能力強(qiáng)的高效菌株，是篩選鑒定過程中獲取適宜菌種的有效途徑。本題中的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)是提高紅霉素的產(chǎn)量，指標(biāo)越大越好，所以應(yīng)該選取每個因素的 K1j、 K2j、 K3j中最大的那個水平。本題中： DBAC,即因素的影響程度為：氯化鋰使用方法＞超聲波誘變時間 ＞超聲波功率＞氯化鋰濃度。極差越大，說明這個因素的水平的改變對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大。在正交實(shí)驗(yàn)中，氯化鋰濃度分別選 %、 %、 %三個水平，并分別采用兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一種方法能取得比較好的致死效果，可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基中始終有氯化鋰存在，對紅色糖多胞菌起著長期誘變的作用，因此誘變效果更好。 （ 2）僅 LiCl 誘變法定水平 Licl 誘變法定水平的實(shí)驗(yàn)采用兩種方法：一是在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鋰；二是用不同濃度的氯化鋰處理孢子后在培養(yǎng)。超聲波功率分別為 200W、 300W、400W，誘變時間分別為 0min、 3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 18min、 2min、24min、 27min、 30min。 B．發(fā)酵罐培養(yǎng) 種子培養(yǎng)的步驟與搖瓶培養(yǎng)相同，發(fā)酵培養(yǎng)就是將上面培養(yǎng)好的二級種子接種于 3L發(fā)酵罐自動發(fā)酵，同時控制發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度、 PH、 接種量、攪拌速度和溶解氧等條件，培養(yǎng) 16h。 30000r/min 培養(yǎng) 4856h 轉(zhuǎn)入二級種子瓶 30000r/min 繼 7 續(xù)培養(yǎng) 2630h，發(fā)酵培養(yǎng)將上培養(yǎng)好的二級種子接種于發(fā)酵瓶， 30000r/min 培養(yǎng) 16h。提取方法是在乙酸丁酯及水溶液（乙酸緩沖液）中反復(fù)萃取。 紅霉素的提取 紅霉素分子結(jié)構(gòu)中有一個二甲基氨基官能團(tuán)，是一個弱堿，在酸性條件下與某些酸會形成鹽，如紅霉素乳酸鹽。經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵液便可進(jìn)行過濾去除菌絲體及沉淀的蛋白質(zhì)。因?yàn)榱蛩徜\呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而被破壞，我們一般要 用 NaoH 來調(diào)節(jié) pH 值。尤以蛋白質(zhì)和油等的存在，在溶媒萃取時將產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。在發(fā)酵期間每隔一定時間也要取樣進(jìn)行分析、鏡檢及無菌試驗(yàn)，檢測生產(chǎn)狀況，分析或控制相關(guān)參數(shù)。發(fā)酵過程中應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵液還原糖量、 pH 值、溶氧量及發(fā)酵液粘度等，以便紅色糖多孢菌能夠大量合成紅霉素并排至胞外。 試驗(yàn)儀器 試管，移液管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，燒杯，錐形瓶，量筒，堿式滴定管，酸式滴定管，膠頭滴管，蒸發(fā)皿，石棉網(wǎng)，小漏斗，試管架，試管夾 ，漏斗，漏斗架 ； 電子天平 (FA2104；上海恒平科學(xué)儀器有限公司 )； 分光光度計 (VIS7220N；北京瑞利分析儀器公司 )； 電熱恒溫水浴鍋 (GSY10；北京市醫(yī)療設(shè)備廠 )； 臺式高速離心機(jī) (TGL20；武漢中科儀器發(fā)展有限公司 )； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (RE5299；上海亞榮生化儀器廠 )； 索氏提取器 (SXT02；上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司 )； 6 凱式定氮裝置 (SBD100；北京市通潤源機(jī)電技術(shù) 有限公司 )； 調(diào)溫電爐 (SXL1200；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司 )； 酸度計 (MP9000；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司 )； 水浴鍋 (DZKW)， 100 mL 三角瓶 ， 10 mL 刻度吸管， 25 mL 刻度吸管，酸式滴定管， 100 mL 容量瓶， 250 mL 錐形瓶， 大試管： 9 支，容量瓶： 50 mL2 ，刻度吸管： 1 mL3 ， 2 mL1 ，5 mL1 。首選于軍團(tuán)菌肺炎、支原體肺炎、白喉帶菌者、沙眼衣原體所致的嬰兒肺炎及結(jié)腸炎；也可用于扁桃體炎、中耳炎、鼻竇炎、大葉性肺炎等。 紅霉素的藥理作用 類似芐青霉素，對革蘭陽性菌有強(qiáng)大抗菌作用，包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、白喉棒狀桿菌及梭狀芽孢桿菌；對革蘭陰性菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、百日咳鮑特菌、布魯菌有較強(qiáng)作用；對嗜肺軍團(tuán)菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體也有作用。 紅霉素的性狀 紅霉素為白色或類白色的結(jié)晶或 粉末 ；無臭，味苦；微有引濕性。這類抗生素結(jié)構(gòu)具有聚烯酮衍生的，被一內(nèi)酯鍵閉合的大環(huán)內(nèi)酯骨架，并通過羥基以糖苷鍵聯(lián)結(jié) 1～ 3個罕有的中性或堿性糖。紅霉素在臨床上的應(yīng)用也很廣泛， 主要用于呼吸道感染、皮膚與軟組織感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染及胃腸道感染等。 紅霉素 是國內(nèi)外應(yīng)用最廣的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素之一 。紅霉素堿能和有機(jī)酸或無機(jī)酸類結(jié)合成鹽，其鹽類易溶于水 [7]。紅霉素熔點(diǎn)為 135～ 140℃ （游離堿水合物）， 190～ 193℃ （無水游離堿）。在水中的溶解度為 2mg/ml（ 25℃ 左右），它隨著溫度的升高而減少。 紅霉素簡介 紅霉素是 1952 年從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離出來的一種 14 元環(huán)大環(huán)內(nèi)醋類堿性抗生素。發(fā)酵過程中可能會產(chǎn)生某些雜質(zhì)，通過簡單的預(yù)處理可能很難完全去除，會導(dǎo)致紅霉 A、 B、 C的分離 效果不好，而常用的預(yù)處理方法在萃取紅霉素時又會造成很大損失。歐洲藥典規(guī)定在紅霉素產(chǎn)品中 ErB的含量不能超過 5%。在發(fā)酵過程中，盡管對環(huán)境的參數(shù)，如發(fā)酵溫度、 pH值、溶解氧濃度（ DO）、 3 接種量等都可以控制得很好，但是由于微生物生長過程是微觀的、不能隨時掌握，發(fā)酵過程中的關(guān)鍵變量如總糖濃度、菌絲濃度不可在線測量，使得發(fā)酵過程的控制問題變得很復(fù)雜 [3]。因此，當(dāng)紅霉素生產(chǎn)中面臨的有效組分偏低等這些問題時，我們?nèi)狈τ行У尼槍π缘慕鉀Q辦法。所以近年來我們在紅霉素高產(chǎn)菌株的篩選方面收效不大。因?yàn)榧t霉素是一種廣譜抗生素藥物，在臨床上應(yīng)用廣泛，所以以提高其產(chǎn)生菌種發(fā)酵單位為目的的遺傳育種工作一直未曾停止。 總體研究現(xiàn)狀 在人類與致病微生物的斗爭歷史上，以抗生素為代表的微生物藥物起到了至關(guān)重要的作用。由于這些原因造成我國生產(chǎn)紅霉素的利潤很低。紅霉素的產(chǎn)生主要通過發(fā)酵，而我國紅霉素發(fā)酵水平都比較低而且是重復(fù)操作，與發(fā)達(dá)國家相比差距還比較大。它的抗菌譜和青霉素 G 相似，特別對抗酸桿菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、病毒及立克次氏體有抗菌活性，如果某些疾病是由耐藥性金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌感染引起的，那么紅霉素應(yīng)該是首先要考慮使用的，它是這方面疾病的首選藥物。同時也可以增強(qiáng)社會認(rèn)知度，擴(kuò)大市場需求，使紅霉素的影響更 廣泛，為人們更好的認(rèn)識了解紅霉素打下基礎(chǔ)。這也給中國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了不小的貢獻(xiàn)。正是由于紅霉素的這種廣泛而必不可少的用途，我國一直在不斷地開發(fā)該領(lǐng)域的應(yīng)用價值。 對青霉素過敏、具有耐藥菌感染的患者可以使用紅霉素 , 它也對支原體、軍團(tuán)菌和厭氧球菌感染等有效，所以它的適應(yīng)癥還在擴(kuò)大。 關(guān)鍵詞： 紅霉素；抗生素；發(fā)酵；糖多孢菌；鏈霉菌 IV Erythromycin strain screening and identification Abstract： Eryth