雙波長(zhǎng)法快速測(cè)定蛋白質(zhì)含量(參考版)
2024-10-03 21:59本頁面
【正文】 其檢測(cè)池所需樣品體積至少 1ml ,因此所需的檢測(cè)樣品較多 ,浪費(fèi)較大。在 450nm波長(zhǎng)時(shí) ,其吸收度 A在一定范圍內(nèi)隨蛋白質(zhì)濃度呈負(fù)相關(guān) ,主要是因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)濃度的增加 ,游離染料逐漸減少 ,所以 A595/ A450隨蛋白質(zhì)濃度變化的靈敏性比 A595更明顯 (圖 4)。這種方法上的略為改進(jìn) ,使考馬斯亮蘭法可廣泛適用于各種要求的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。單波長(zhǎng) 酶標(biāo)法靈敏度為 0. 976μg/ ml ,而傳統(tǒng)考馬斯亮蘭靈敏度為 2μg/ ml ,可見減少誤差會(huì)提高實(shí)際測(cè)量的靈敏度。雙波長(zhǎng)測(cè)定法比單波長(zhǎng)測(cè)定法定靈敏度高 ,主要是由于雙波長(zhǎng)法不但反映了考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)結(jié)合物的吸收度 ,而且也反映了游離染料的吸收度。而采用酶標(biāo)儀作檢測(cè)儀 ,所需樣3 討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí) ,在考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí) ,采用雙波長(zhǎng)測(cè)定法其靈敏度可提高至0. 122μg/ ml ,為單波長(zhǎng)測(cè)定法靈敏度 ( 0. 976μg/ ml )的 8倍。表明單、雙波長(zhǎng)測(cè)定法在檢測(cè)限內(nèi)其吸收度與蛋白質(zhì)濃度呈良好線性關(guān)系。A595/A450 C直線關(guān)系為 y = 0. 2011x + 1. 0395 ,相關(guān)系數(shù) r2 = 0. 9965 。同理作圖 3c、3d ,A595單波長(zhǎng)檢測(cè)上限為 7. 81μg/ ml ,最低檢測(cè)下限為 0. 976μg/ ml。蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 2000 。A595/ A450在線性范圍內(nèi)隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 A595靈敏。分別以 A595 C ,A450 C和 A595/ A450 C作圖 ,觀察單波長(zhǎng)吸收度和雙波長(zhǎng)吸收度之比與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系。20 (1)從吸收光譜圖可知 ,考馬斯亮蘭 蛋白質(zhì)結(jié)合物的最大吸收波長(zhǎng)為 590nm ,考馬斯亮蘭染料的最高吸收波長(zhǎng)為 460nm ,590nm波長(zhǎng)下游離考馬斯亮蘭染料也有較高的吸收度 ,而 460nm處染料 蛋白質(zhì)結(jié)合物無吸收度。以稀釋的染料為待測(cè)樣本 ,繪制游離考馬斯亮蘭染料的吸收光譜 (圖 lb)。2 結(jié)果2. 1 吸收光譜 : 0. 8ml稀釋的染料加入 0. 2ml5mg/ ml的牛血清蛋白 ,使考馬斯亮蘭完全與蛋白結(jié)合
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