【正文】 華北藥廠抗生素研究所，石家莊，生產用抗生素菌種? CVCC– 獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，農業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所謝謝觀看 /歡迎下載BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH。四川抗生素工業(yè)研究所，成都， 我國有中科院負責擔負全國菌種保存業(yè)務， 6個保存中心? CCGMC– 普通微生物菌種保藏管理中心，微生物所：真菌，細菌。DevelopmentResearchNorthern國際衛(wèi)生研究所 of? NIH– NationalCultureofCompany? NCTC– NationalKaken日本大阪? KCC– 科研化學有限公司 FermentationMicrobiology? IFO– InstituteofHarbar? CSM– 冷泉港研究室，美 ColdCollectionType國內外主要菌種保存機構 ? 安瓿管要求：所用的管需能承受大的溫差而不至于破裂，貼好標簽。 如美國 ATCC導用先將菌液降低到 0℃ ，然后以1℃ /min下降，一直降低到 35℃ ，然后才把裝有菌液的安甑管放入液 N罐中。② 凍結（關鍵）l 先把微生物從常溫過渡到低溫，這樣使細胞接觸低溫前，使細胞內自由水通過膜滲出而不使其溫冷形成結晶而傷害細胞。適用廣泛，尤其是不產孢的菌絲體，保存方法理想，保存期最長。– 7. 液氮超低溫保存法– 原理：保存溫度 196℃ ，遠低于微生物新陳代謝作用停止的溫度 130℃ 。187。– 可加適當?shù)谋Ｗo劑：脫脂牛奶或血清– 作用：187。–基本操作：? 將微生物制成懸液，再與保護劑混合放在特制安瓿管中，用低溫酒精或干冰，使其迅速凍結，用真空泵抽干。? 微生物的生長代謝暫時停止，不易發(fā)生變異。 – 具體操作：? ⑴ 配制 50％甘油溶液， 121℃ 滅菌備用? ⑵ 制備菌懸液：濃度 10^8－ 10^10? ⑶ 菌懸液和甘油溶液以等體積混合均勻， 20℃ 保存5. 石蠟油封存法– 向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上倒一層滅過菌的石蠟油，用量及斜面 1cm，保存于冰箱中。– 用斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或將斜面孢子刮下，直接與沙土混合，置干燥皿中真空泵抽干，冰箱保存，一年左右。2. 斜面冰箱保存法：– 用新鮮斜面培養(yǎng)基接種后，置最適條件下等菌體或孢子長滿后，冰箱 4℃ 保存，一般保存3－ 6個月。– 一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于休眠狀態(tài)，抑制其繁殖能力。菌種的保存1. strainculturelevel）和 in4. 采用有效的菌種保藏方法– 不同的菌種采用不同的保存方法，可有效地降低菌種的衰退速度（二）、菌種的復壯1. 純種分離法– 純種分離法有 “菌落純 ”水平（ pure3. 利用不易衰退的細胞傳代– 在放線菌或霉菌中，菌絲含有多個細胞核，甚至有異核體，用菌絲接種就易出現(xiàn)變異或衰退，而孢子是單肥單核就不會出現(xiàn)在實踐中用棉花蘸放線菌孢子斜面接種。? 在 Aspergillus發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造一個適合原種的生長條件，可在一定程度上防止衰退? 衰退的防止1. 控制傳代次數(shù)– 復壯–狹義復壯? 是一種消極措施是指菌種在已發(fā)生衰退的情況不經(jīng)過純種分離和測定典型性狀，產生性能等指標，從已衰退的的種群中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達到恢復原菌株固有性狀的相應措施。? ⑵ 生長速度變慢，產生孢子變少? ⑶ 代謝產物能力下降，即 “負變 ”? ⑷ 致病菌對寄主侵染力的下降? ⑸ 對外界不良條件包括低溫，變溫等抵抗能力的下降– 衰退是一個由量變到質變的過程，開始是個別細胞發(fā)生自發(fā)突變，經(jīng)一代代傳遞，導致在種群種擴大，發(fā)展為優(yōu)勢種群，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重衰退。具體表現(xiàn)：? ⑴ 原有形態(tài)性狀變得不典型，如 Bacillus、菌種的衰退與復壯? 衰退– 由于自發(fā)突變的結果，而使某物種原有一系列生物學性狀發(fā)生質變成量變的現(xiàn)象。保存菌種不變異是不可能的事，沒有一種方法可使其絕對不變，研究菌種保存就是要采樣最合適的方法保存，使菌種的變異和死亡減少到最低程度。? ? 菌種保存是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分。第四節(jié) 含 2n1條染色體的核將逐漸回復為含 n條染色體的單倍體核，從而實現(xiàn)單倍體化。? 非整倍體核是不穩(wěn)定的，在隨后的分裂過程中會丟失染色體直到回復到整倍體216。V. 單倍體化：? 雙倍體雜合子的遺傳性狀不穩(wěn)定，進行有絲分裂時，核內的 染色體 偶爾發(fā)生交換和單倍體化，形成具有新性狀的 單倍體雜合子 。? 雙倍體核一旦形成， 就會很穩(wěn)定，并分裂產生更多的雙倍體核。： 異核體兩個不同細胞核發(fā)生 核融合 (核配 )，產生雙倍體雜合子核。發(fā)生頻率極低。 準 性生殖hybridization)把來自不同親本、不同性別的單倍體細胞接觸，產生雙倍體雜交后代，從子代中選育出優(yōu)良性狀的雜種。有性雜交育種原生質體融合的一般步驟制備原生質體原生質體融合原生質體再生篩選融合子二、真核微生物的基因轉移與重組基因重組方式：1) 有性生殖2) 準性生殖3) 原生質體融合4) 遺傳轉化（一）、有性雜交定義? 有性 雜交 ，指不同遺傳型的 性細胞間 發(fā)生接合和進行染色體重組產生新的遺傳性狀后代的 育種技術。通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程，稱為原生質體融合。轉導、轉化、接合的總結〈 四 〉 、原生質體融合? 原生質體融合（ protoplast③ 發(fā)生接合中斷， F成了一個部分雙倍體，在那里，供體細胞（ Hfr）的單鏈 DNA片段合成了另一條互補的 DNA鏈。接合過程一般可分為：① Hfr與 F細胞配對。 不同的是進人 F菌株的單鏈染色體片段經(jīng)雙鏈化后，形成部分合子（ merozygote? F’ 菌株 ： 當 Hfr菌株細胞內的 F質粒因不正常切離而脫離核染色體組時，可重新形成游離的、但攜帶整合位點鄰近一小段核染色體基因的特殊 F質粒，稱 F’ 質?；?F’ 因子。d) 在 F中，線形外源DNA單鏈 (B)合成互補雙鏈 (BB’)，經(jīng)環(huán)化后，形成新的 F質粒，完成 F至 F+的轉變。 F＋ 菌株 F質粒 DNAB. 兩條 DNA鏈分開，斷裂的單鏈 (B)逐步解開，留存的環(huán)狀單鏈 (A)以 “滾環(huán)式滾環(huán)式 ” 復制 互補單鏈 (A’)。T 當 F＋ 菌株與 F— 菌株接觸時，通過 F＋ 菌株 性菌毛的溝通和收縮， F質粒由 F＋ 菌株轉移至 F菌株中，同時 F＋ 菌株中的 F質粒也獲得復制，兩者都為 F＋ 菌株。細胞內存在一至幾個 F質粒，細胞表面著 生一至幾條性菌毛的菌株。根據(jù) F質粒在細胞內的存在方式，可 把 E． coli分成 4種不同接合型菌株。 ? 接合： 供體菌 (“雄性 ”)通過性菌毛與受體菌 (“雌性 ”)直接接觸，把 F質?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。溶源性細菌溶源轉變與局限轉導，但本質上不同：① 溶源轉變不攜帶任何外源基因的正常噬菌體；② 賦予宿主新性狀是噬菌體的基因，不是供體菌的基因；③ 新性狀是宿主細胞溶源化時的表型，溶源化后形成溶源性細菌，而不是經(jīng)遺傳重組形成的穩(wěn)定轉導子；④ 溶源轉變獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時消失。 50%的 轉導子。低頻轉導：形成少數(shù)轉導子， 104～ 106216。通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的 少數(shù)特定基因 攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉導子的現(xiàn)象。(restricted完全普遍轉導流產普遍轉導 簡稱流產轉導 (abortive transduction)、經(jīng)轉導噬菌體的媒介而獲得了供體菌 DNA片段的受體菌，外源 DNA在其內既不進行交換、整合和復制、也不迅速消失，而表現(xiàn)穩(wěn)定的轉錄、轉譯和性狀表達，這一現(xiàn)象就稱流產轉導 。完全普遍轉導 噬菌體 病毒外殼把完全不含自身 DNA的供體 DNA“ 誤包 ” 成