【正文】 。 冷凍干燥保藏法 （干燥、低溫、無氧、有保護(hù)劑），適用各大類，保藏期限可達(dá)515年，繁而高效。 （三）實(shí)驗(yàn)室常用菌種保藏方法 固體斜面定期移植法（低溫 4℃ 下）， 適用各大類，保藏期 16個(gè)月。 世界上最大的菌種保藏中心：美國典型菌種保藏中心（ ATCC）如：細(xì)菌、病毒、寄生蟲、動(dòng)物細(xì)胞等。 三、菌種保藏 創(chuàng)造一個(gè)很好的微生物休眠環(huán)境（干燥、低溫、缺氧氣、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸度中和劑） ,使菌種處于休眠狀態(tài) ,得以妥善保存。幾代后，發(fā)生衰退時(shí)，再注射回動(dòng)物（寄主）體內(nèi)。 （二）菌種復(fù)壯的措施 目的：通過純種分離取得群體中仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞。 。 。 采用良好的保藏方法是較少傳代的有效途經(jīng)。 基因工程 返回目錄 第五節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯和保藏 一、菌種的衰退 （一）衰退的概念：由于遺傳變異導(dǎo)致菌種的生物學(xué)性狀改變的現(xiàn)象。 （四）“工程菌”或“工程細(xì)胞株”的表達(dá)、檢測。 （二）載體系統(tǒng)的選擇。 返回目錄 第四節(jié) 基因工程 一、基因工程定義：是在基因水平上的遺傳工程，它是利用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)（ DNA大分子）提取出來，在離體條件下用適當(dāng)工具酶進(jìn)行切割后，把他與作為載體的 DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，讓外源遺傳物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)。 （二）準(zhǔn)性雜交 。 ：兩個(gè)細(xì)胞的核膜融合在一起，形成雙倍體雜合子核（不穩(wěn)定）。 （二）準(zhǔn)性雜交 主要步驟： ：兩個(gè)遺傳性狀不同的單倍體菌絲細(xì)胞相互接觸，叫菌絲結(jié)合或菌絲聯(lián)結(jié)。 原生質(zhì)體融合 (protoplast fusion) 二、真核微生物基因重組 （一）有性雜交： 凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都可以通過性細(xì)胞的接合而發(fā)生的染色體重組，產(chǎn)生新遺傳型后代。 (五 )原生質(zhì)體融合 通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時(shí)帶有雙親性狀的、穩(wěn)定的融合子的過程。次生 F′ 細(xì)胞是一部分雙倍體。此時(shí)的性狀界于 Hfr與 F+菌株之間，稱初生 F′ 菌株； F′ 菌株與 F菌株結(jié)合，后者也變成 F′ 菌株。然后整條線性染色體以等速轉(zhuǎn)移至 F菌株內(nèi)，因轉(zhuǎn)移所需時(shí)間較長，且容易發(fā)生中斷，導(dǎo)致 Hfr與 F結(jié)合的結(jié)果其重組頻率最高，但轉(zhuǎn)性頻率最低。 Hfr（高頻重組）菌株 因其與 F菌株結(jié)合后，發(fā)生重組的頻率比 F+要高數(shù)百倍，故得名。 通過細(xì)胞間的直接接觸能進(jìn)行大 段ＤＮＡ的轉(zhuǎn)移的過程，叫接合 接 合 及 其 發(fā) 現(xiàn) + A+B+CD ABC+D+ A+B+C+D+ （四）接合 以 ，按細(xì)胞內(nèi)有無 F因子及其存在方式的不同可分為四種： F+（雄性）菌株 有游離的 F因子 1— 4個(gè)，體外有對應(yīng)數(shù)量的性菌毛，當(dāng)其與 F菌株接合時(shí)，通過性菌毛可將 F因子傳遞給后者，使之轉(zhuǎn)變?yōu)?F+菌株。 （四）接合 供體菌（雄性）通過性菌毛與受體菌接觸，前者將不同長度的單鏈 DNA片段傳遞給后者并在后者細(xì)胞中雙鏈化，進(jìn)一步與核染色體交換、整合，使受體菌獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。 獲得新性狀的是溶源化的宿主細(xì)胞而不是轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別： 溫和噬菌體本身不攜帶外源基因，使宿主帶有新性狀的是噬菌體本身的基因。見下圖 （ 2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（ HFT） 用低頻裂解物（含 105的部分缺陷噬菌體）來感染受體菌，即有 105變?yōu)榈皖l局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子，再用高感染復(fù)數(shù)的正常噬菌體去感染低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子，此時(shí)的低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子稱為雙重溶源菌，它被誘導(dǎo)后可產(chǎn)生裂解，正常的噬菌體可協(xié)助缺陷噬菌體進(jìn)行等量復(fù)制，用這樣的裂解物（高頻裂解物，含50%正常噬菌體）再去感染受體菌，進(jìn)行高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，亦稱高頻局限轉(zhuǎn)導(dǎo)。 分類：局部轉(zhuǎn)導(dǎo)按其轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的高低可分為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（ LFT）和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（ HFT）兩大類。 （ 2）特定基因由部分缺陷型的噬菌體攜帶。該溶源菌因誘導(dǎo)發(fā)生裂解時(shí)，其中極少數(shù)的前噬菌體會(huì)發(fā)生不正常切離，將噬菌體結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)之一的少數(shù)基因連接到噬菌體 DNA上，同時(shí)噬菌體也會(huì)將相應(yīng)的一段 DNA留在宿主染色體組上，最后噬菌體的衣殼將非正常切離的噬菌體染色體進(jìn)行誤包，即形成了部分缺陷噬菌體。 完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) (pietetransduction) 供體 AB+ A+B 多數(shù)受體 形成溶源菌 AB+ A+B 少數(shù)受體 A+B+ 經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子 AB+色氨酸缺陷型 A+B組氨酸缺陷型 鼠傷寒沙門氏菌 （ 2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 完全缺陷噬菌體感染受體后，所攜帶的 DNA片段沒有和受體菌的 DNA片段交換、整合、復(fù)制，但可以轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，有相應(yīng)的表型；受體菌再經(jīng)分裂、繁殖，子一代只有一半獲得供體菌的 DNA片段，另一半僅得到部分代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出輕微的供體菌特征，在繼續(xù)分裂的過程中，逐漸被稀釋，此現(xiàn)象稱為流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。 １、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) （ 1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 完全缺陷噬菌體：當(dāng)某噬菌體感染供體菌后，在供體菌內(nèi)增殖時(shí)，使供體菌的 DNA被切成許多片段，成熟后少數(shù)衣殼將供體菌的 DNA片段（要求與噬菌體核酸片段相仿）“誤包”，形成假噬菌體，即完全缺陷噬菌體 。 分類：普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 局部轉(zhuǎn)導(dǎo) （二）轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別： 轉(zhuǎn)化：受體菌直接接受供體菌 DNA片段。 轉(zhuǎn)導(dǎo)子：通過轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 轉(zhuǎn)染過程不發(fā)生基因重組，受體菌僅接受噬菌體或病毒的 DNA 或 RNA、不產(chǎn)生雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子，產(chǎn)生的是大量的子代噬菌體或病毒。 （一）轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染：將噬菌體或病毒的 DNA或 RNA提取出來，再去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代的現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)化過程見下圖 （一）轉(zhuǎn)化 兩個(gè)菌株間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化與多種因素