elisa-雙抗夾心法檢測(cè)抗原(參考版)
2024-08-16 01:19本頁(yè)面
【正文】 ?底物有 毒性 ，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，盡量避免接觸。末次洗板盡量將水甩干。將所加物加在 ELISA板孔的底部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 1/8 1/16 1/32 待測(cè)抗原 100μl 空白對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照 每組 4位同學(xué)的加樣順序： 待測(cè)抗原 100μl 待測(cè)抗原 100μl 1. 樣本有 4種，每人選一種做復(fù)孔 2. 每組做陽(yáng)參 2個(gè)孔 3. 每組做空白對(duì)照 2個(gè)孔（加樣 1 Assay buffer） 每孔加樣 100μl 待測(cè)抗原 100μl 6. 洗板： 棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 4 3min，控干； Ab: 用 1 Assay diluent 1:1000稀釋 detection Ab ，100μl /孔， 37℃ 避光孵育 1h； 8. 洗板： 棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 4 3min，控干； 9. AvidinHRP(HRP見(jiàn)光分解，之后所有步驟避光操作） 用 1 Assay diluent 1:250稀釋 AVHRP ， 100μl /孔， 37℃ 避光孵育 45min； 10. 洗板： 棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 5 3min，控干 ； 11. 顯色： 1 TMB solution， 100μl/ 孔， 37℃ 孵育 130min； 12. 終止反應(yīng)： 顯色完全后加 2M H2SO4 50μl/ 孔，終止顯色反應(yīng) 。 棄去孔內(nèi)液體，用 %PBST洗板 4次，（將PBST加入每孔，靜置 3min 后傾去）；控干； 37℃ 避光孵育 2h （ Note 1 Assay diluent：用純水將 5 Assay diluent 稀釋至 1 ） 以上助教老師負(fù)責(zé)完成 5. 加樣 抗原與抗體孵育 1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 1 Assay diluent 倍比稀釋 standard，每個(gè)梯度各取 100μl加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔； 2）待測(cè)樣品： 取 100μl待測(cè)樣品加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔； 3）空白對(duì)照 ：取 100μl 1 Assay diluent加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔； 37℃ 避光孵育 1h 50ul Standard 原液 189。 濕盒中， 4℃ 過(guò)夜 酶標(biāo)板 (Note PBST洗滌液 :% Tween20 PH 1 PBS) 1 Coating buffer 1:1000稀釋 Capture Ab ， 100μl/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜 (或保鮮膜等）封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中， 4℃ 過(guò)夜。 包被 ? 定義：將抗原或者抗體固定在固相載體的過(guò)程稱為包被； ? 物理吸附：兩者的疏水基團(tuán)通過(guò)疏水鍵的作用 ? 抗體或者蛋白質(zhì)抗原一般采用 為稀釋液（即本次實(shí)驗(yàn)用的 coating buffer） ? 48℃ 包被過(guò)夜 (有利于蛋白活性的保持），與 37℃ 孵育2小時(shí)被認(rèn)為具有相等的包被效果 ? 包被的最適當(dāng)濃度隨著載體和包
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