elisa-雙抗夾心法檢測抗原-免費閱讀
【正文】 ?洗板 ：每次洗液加入后，應(yīng)靜置 3分 min使清洗更加徹底。 加樣 ? ELISA中一般有 3次加樣步驟，即，加樣本（和/或標(biāo)準(zhǔn)品），加酶結(jié)合物，加底物； ? 加樣時應(yīng)將所加物加在 ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以濺出 ,不可以產(chǎn)生氣泡； ? 多道加液器的使用 孵育 (溫育） ? 在 ELISA中抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫的過程稱為孵育； ? 常用溫度： 43℃ ， 37℃ ，室溫， 4℃ 等 ? 孵育時為了避免蒸發(fā)，可以用塑料封口膠或者保鮮膜封板 洗滌 洗滌在 ELISA中雖然不是一個反應(yīng)步驟，但決定了實驗的成敗 ? 聚苯乙烯等塑料對蛋白的吸附是普遍的，洗滌可以清除在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì) ? 洗滌可以清除殘留在板孔中沒有能夠與固相抗原或者抗體結(jié)合的物質(zhì) ? 常加入非離子表面活性劑（含有疏水基團 +親水基團），以抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面，如吐溫 20，%的濃度比較合適，濃度＞ 2%會洗脫包被在板上的抗原或者抗體 洗滌方式： ? 甩干孔內(nèi)的反應(yīng)液 ? 浸泡，即將洗滌液注滿板孔 (約 300μl），靜置 3min，浸泡時間不可以隨意縮短； ? 甩去液體后在吸水紙上拍干 ? 重復(fù)操作 2， 3，洗滌次數(shù)按要求操作 顯色和比色 顯色是 ELISA中的最后一步孵育反應(yīng)，此時，酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物； ? 定量實驗中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)該按規(guī)定力求準(zhǔn)確；定性測定的顯色時間一般不需要嚴(yán)格控制和及時判斷； ? 終止反應(yīng)，防止反應(yīng)過度： TMB受光照影響不大，經(jīng) HRP作用后， 40min達到高峰；終止液有多種，疊氮鈉或 SDS等酶抑制劑可以維持藍色 1224h不褪色； OPD受光照會自行變色，要避光，經(jīng) HRP作用后， 37℃ 孵育 2030min后顏色即不再加深；常用終止液為 2M H2S04； HRP的色原底物系統(tǒng) 與 HRP反應(yīng)后的顏色 加終止液后的顏色 讀數(shù)波長 特 點 OPD 臨 苯二胺 492nm 致畸， 但本底好 TMB 四甲基聯(lián)苯胺 450nm 操作方便， 本底較高 ELISA 數(shù)據(jù)的處理 ? 根據(jù) standard的濃度和對應(yīng)的 OD值計算出線性方程 ? 將所測定樣品的 OD值代入方程計算出相應(yīng)的樣品的濃度 Protocal 1. 包被：用 Coating buffer 1:1000稀釋 Capture Ab ， 100ul/孔，濕盒 4℃ 過夜； 2. 洗板：棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 3 3min，控干； 3. 封閉：加 1 Assay diluent 200ul/孔， 37℃ 避光孵育 2h； 4. 洗板：棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 4 3min，控干； 5. 加樣： 100ul/孔， 37℃ 避光孵育 1h ； 6. 洗板：棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 4 3min，控干； 7. BiotinDetection A
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