elisa知識(shí)簡(jiǎn)介(參考版)
2025-07-18 22:50本頁(yè)面
【正文】 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 4. ELISA的操作要點(diǎn) 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證 ELISA必要條件。 a. 陽(yáng)性判定值法 陰性判定值 = NCX+ PCX 陽(yáng)性 A≤ 陽(yáng)性判定值 陰性 A＞陽(yáng)性判定值 b. 抑制率法 抑制率（ %） = （陰性對(duì)照 A值 標(biāo)本 A值） 100%/陰性對(duì)照 陽(yáng)性 抑制率 ≥ 50%為 陰性 ＜ 50% 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 定量測(cè)定 ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對(duì)照（ N）的 A值后，計(jì)算 S/N值。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 ： （ cutoff value） 一般為陰性對(duì)照 A值加上一個(gè)特定的常數(shù) ()，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。在競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 6 結(jié)果判斷 定性測(cè)定 定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出 “ 有 ” 或 “ 無(wú) ” 的回答，分別用 “陽(yáng)性 ” 、 “ 陰性 ” 表示。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。 操作時(shí)室溫宜在 1530℃ ，使用前先預(yù)熱儀器 1530分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到 ，準(zhǔn)確性為 177。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于 A字母的右下角，如 OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為 A492nm或 OD492nm。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 比色 拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是 疏水性 的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。 （ 2）浸泡式 微量滴定板多采用。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。 洗滌的方式除某些 ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有 流水沖洗式和 浸泡式兩種： 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 （ 1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。 聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。 ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。 室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指 2025℃ ，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書的要求控制溫育。 若用保溫箱： ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將 ELISA板放在濕紗布上。 37℃ 是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在 LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。 以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有 纖維蛋白原 和 抗凝劑 外，其他成份同血清。例如 HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含 HBsAg，最好抗 HBs也是陰性。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 4 對(duì)照設(shè)定 陽(yáng)性對(duì)照品 (positive control)和陰性對(duì)照品 (negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)
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