elisa知識(shí)簡(jiǎn)介-文庫(kù)吧資料
2025-07-21 22:50本頁(yè)面
【正文】 果的對(duì)照。 AP也有發(fā)熒光底物（磷酸 4甲基傘酮），可用于 ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在 405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。 HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于 H2O小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物 (urea peroxide)。酶反應(yīng)終止后， TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。 E 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 TMB經(jīng) HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。 DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 酶的底物 HRP的底物 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在 492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是 HRP結(jié)合物最常用的底物。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上： %牛血清白蛋白， %吐溫 20 。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（ HRP結(jié)合物加硫柳泵， AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。簡(jiǎn)便有效 . 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響 ELISA中最后的酶活性測(cè)定。 （ 2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。有效（結(jié)合率達(dá) 60%70%）和重復(fù)性好。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 結(jié)合物的制備 酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。 在 ELISA中， HRP， AP，葡萄糖氧化酶， β D半乳糖苷酶和脲酶等。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 酶 純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B 結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是 ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2抗體（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。脫脂奶粉 ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（ 5%）。 常用封閉劑： %%的 BSA。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 封閉 封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 包被的條件 pH78的 TrisHCL緩沖液。 腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 包被用抗體 IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在 Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 包被用抗原： 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。 優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。 親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的 DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的 疏水基團(tuán) ，故更易吸附到固相載體表面。 蛋白質(zhì) 與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。 良好的 ELISA板應(yīng)該是 吸附性能好 ， 空白值低 ， 孔底透明度高 ，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間 性能相近 。 聚氯乙烯。 原理 類型 試劑準(zhǔn)備 對(duì)照 標(biāo)本 結(jié)果 ABSELISA法 ① ：固相支持
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