elisa-雙抗夾心法檢測(cè)抗原(存儲(chǔ)版)
【正文】 b: 用 1 Assay diluent 1:1000 稀釋 detection Ab ， 100ul/孔， 37℃ 避光孵育 1h； 8. 洗板：棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 4 3min，控干； 9. AvidinHRP: 用 1 Assay diluent 1:250稀釋 AVHRP ， 100ul/孔， 37℃ 避光孵育 45min； 10. 洗板：棄去孔內(nèi)液體， PBST洗滌， 5 3min，控干； 11. 顯色： 1 TMB solution， 100ul/孔， 37℃ 孵育 130min； 12. 終止反應(yīng)：顯色完全后加 2M H2SO4 50ul/孔，終止顯色反應(yīng)； 于 450nm處讀取光密度 OD值或吸光度 A值； 13. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析數(shù)據(jù) 次日，棄去孔內(nèi)液體，用 %PBST洗板 3次（將PBST加入每孔，靜置 3min 后傾去），控干，洗去游離抗體。 ELISA 雙抗體夾心法檢測(cè)抗原 王春 復(fù)旦大學(xué)免疫學(xué)系 復(fù)旦大學(xué)免疫生物學(xué)研究所 細(xì)胞與分子免疫學(xué)技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay ， ELISA) 一種固相酶免疫測(cè)定技術(shù)，利用酶標(biāo)記的抗原或者抗體，在固相載體上定量或定性測(cè)定特異性抗體、可溶性抗原及細(xì)胞表面抗原。 濕盒中， 4℃ 過(guò)夜 酶標(biāo)板 (Note PBST洗滌液 :% Tween20 PH 1 PBS) 1 Coating buffer 1:1000稀釋 Capture Ab ， 100μl/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜 (或保鮮膜等）封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中， 4℃ 過(guò)夜。末次洗板盡量將水甩干。將所加物加在 ELISA板孔的底部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 包被 ? 定義：將抗原或者抗體固定在固相載體的過(guò)程稱為包被； ? 物理吸附：兩者的疏水基團(tuán)通過(guò)疏水鍵的作用 ? 抗體或者蛋白質(zhì)抗原一般采用 為稀釋液（即本次實(shí)驗(yàn)用的 coating buffer） ? 48℃ 包被過(guò)夜 (有利于蛋白活性的保持），與 37℃ 孵育2小時(shí)被認(rèn)為具有相等的包被效果 ? 包被的最適當(dāng)濃度隨著載體和包被物的性質(zhì)和酶結(jié)合物的濃度調(diào)定 封閉 ? 定義：繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程； ? 目的：抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度比較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量的不相關(guān)蛋白質(zhì)填充這些空隙，從而排斥在 ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附； ? 常用封閉液： 2%牛血清白蛋白， 10%NBS+5%羊血清， 5%脫脂奶粉； 本實(shí)驗(yàn)用封閉液： 1 Assay buffer。 1971年由瑞典學(xué)者 Engrall和 Perlmann,荷蘭學(xué)者weeman和 Schuurs報(bào)道； 開(kāi)創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法； ELISA測(cè)抗原（ Ag）或抗體（ Ab）三要素 ? 抗原或抗體的 固相化 ：已知的 Ag/Ab結(jié)合到
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