【正文】 SERS免疫分析 。 ?1997年， 《 Science》 上， Shuming Nie 和 利用 Ag和 R6G進(jìn)行了單分子、單納米粒子檢測(cè)。|A(?s)|2I(?l)I(?l) 拉曼譜線強(qiáng)度提高 104106倍。 3000 2022 1500 1000 500 拉曼位移 /cm1 3600 I C—C C—H 拉曼譜的去偏振度及其測(cè)量 去偏振度 ? 與分子的極化度有關(guān)，如果分子的極化度中各向同性部分為 ?，各向異性部分為 ?， 則 ? = 3 ?2 45 ?2 + 4 ?2 對(duì)球形分子 ? =0， 所以 ? = 0 分子各向異性 ? = 0， ? =3/4 所以 ? 0 因此， ?越小，分子對(duì)稱性越高 通過測(cè)量拉曼譜線的去偏振度可以確定分子的對(duì)稱性 C N（ CH3） 2 N（ CH3） 2CI （ CH3） 2 N C N（ CH3） 2 N（ CH3） 2 （ CH3） 2 N + + 測(cè)得： ? 0 故為對(duì)稱結(jié)構(gòu) 結(jié)晶紫 去偏振度測(cè)量 ? = I? I// 入射光 拉曼散射 偏振器 5. 拉曼光譜的強(qiáng)度 I = K (?0 ?) 4 I0 ( ) d? dr (三 )、 拉曼光譜儀 光源 單色器 檢測(cè)器 樣品室 光源 通常采用激光光源 （ 1） HeNe激光器 主要波長(zhǎng) nm （ 2）氬離子激光器 主要波長(zhǎng) nm nm —— 與 Rayleigh散射一樣，拉曼散射的強(qiáng)度反比于波長(zhǎng) 的四次方，因此使用較短波長(zhǎng)的激光可以獲得較 大的散射強(qiáng)度 —— 熒光干擾拉曼光譜的測(cè)定，因此當(dāng)樣品或雜質(zhì)有 熒光時(shí)，使用較短波長(zhǎng)的激光也獲得較大的熒光 干擾 樣品室 ——樣品池的設(shè)計(jì)可用于測(cè)不僅液體、固體、也可氣體 ——可進(jìn)行變溫、變壓實(shí)驗(yàn) ——為防止樣品在強(qiáng)光照射下分解，可設(shè)置旋轉(zhuǎn)池 單色器 色散型 ： 色散性好且降低雜散光影響 常采用雙光柵分光 非色散型： 采用傅立葉變換型儀器 (四 )、檢測(cè)器 早期采用攝譜儀 現(xiàn)采用光電倍增管和 CCD 顯微拉曼分析儀器 CCD ?Unfiltered ?Filtered without R6G ?2 1011M R6G ?2 1011M R6G ?2 1010M R6G ?2 109M R6G (五 )、高靈敏度拉曼光譜分析的應(yīng)用 傳統(tǒng)上認(rèn)為，拉曼光譜的主要缺點(diǎn)是靈敏度低，其強(qiáng)度較熒光若 10121014數(shù)量級(jí)，因此應(yīng)用受到限制。例如：極性基團(tuán)振動(dòng)時(shí)常伴隨偶極矩 變化，因而產(chǎn)生較強(qiáng)的紅外吸收，非極性基團(tuán) 振動(dòng)時(shí)極化度變化越大，拉曼散射越強(qiáng)，故非 極性基團(tuán)分析常用拉曼光譜 C—C S—S N—N 拉曼強(qiáng) ? 相互允許原則：凡是沒有對(duì)稱中心的分子， 紅外和拉曼都是活性的 ? 相互禁阻規(guī)則：對(duì)于少數(shù)分子的振動(dòng)，其紅 外和拉曼光譜都是非活性的。 ? = ?0 + （ d ?/dq)0q （ 2） 式中 ?0是分子在平衡位置的極化度 q是雙原子分子的振動(dòng)坐標(biāo) q = r – re 式中 r 是雙原子分子的核間距 re是平衡位置的核間距 已知： q = q0 cos2??t 所以 P = ? 0E0cos2??0t + 1/2 q0E0（ d ?/dq)0 [cos2?(?0 ?) t + cos2?(?0+ ?) t ] 瑞利散射 拉曼散射 Stokes線 反 Stokes線 （ d ?/dq)0 = 0是拉曼活性的依據(jù)，分子振動(dòng)時(shí)極化度隨振動(dòng)改變就會(huì)產(chǎn)生拉曼散射，即分子具有拉曼活性。分子的電偶極矩由下式表示： P = ? E = ? E0cos2??0t （ 1） 分子的電子云在交變電場(chǎng)作用下會(huì)誘導(dǎo)出電偶極矩 P ?——分子的極化度（ Polarizability) E——入射光的 交變電場(chǎng)強(qiáng)度 分子的極化度反映分子的屬性。 拉曼位移取決于分子的振動(dòng)能級(jí)的改變，不同的化學(xué)鍵或基團(tuán)有不同的振動(dòng)能級(jí)， 與之相對(duì)應(yīng)的拉曼位移 ? ?也是特征的，這是拉曼光譜作為分子結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)。 若令 I 為兩光束干涉后的強(qiáng)度，則 I（ ?） = I(?) Cos2? ?/ ? 或 I（ ?） =(?) Cos2??? 以上討論的是單色光的干涉，若同時(shí)有多個(gè)頻率的光，則任意頻率的光強(qiáng)隨兩鏡距離之差為： Ii(?)=(?i)Cos2??i ? 總光強(qiáng)為 I(?)=? Ii(?)= ? Ii(?i)Cos2??i ? +? ? I(?)=? (?)Cos2???d? 若光的波長(zhǎng)連續(xù)分布 以上討論的是 Michelson干涉儀移動(dòng)時(shí)兩鏡相差任意 ?時(shí)的光強(qiáng) I(?)，而我們更關(guān)心光強(qiáng)隨波長(zhǎng)的變化 I（ ?）而不是光強(qiáng)隨兩鏡距離差的變化 I(?) +? ? I(?)=? (?)Cos2???d? +? ? I (?)=? I(?)Cos2???d? 傅立葉變換 （時(shí)域譜） （頻域譜） 4 0 0 0 . 0 3000 2022 1500 1000 4 5 0 . 0c m 1A I (?) ? 傅立葉變換的優(yōu)點(diǎn)： FTIR不需要分光，因此檢測(cè)器接收到的光通量較色散型儀器大得多，因此提高了信噪比和靈敏度，有利于弱光譜的檢測(cè)； FTIR的掃描速度極快，能在很短的時(shí)間里（ 1s）獲得全譜域的光譜響應(yīng)； FTIR儀器與計(jì)算機(jī)技術(shù)的結(jié)合，使 IR的整機(jī)性能大大提高，價(jià)格下降，使 FTIR的商品儀器獲得了普及。 測(cè)量步驟： 測(cè)得一組包含原輻射全部光譜信息的干涉圖； 經(jīng)計(jì)算機(jī)進(jìn)行傅立葉變換，獲得紅外吸收光譜圖。這些材料易吸潮，故操作環(huán)境應(yīng)干燥 （ C）光聲光譜 強(qiáng)吸收、高分散、不透明的樣品，如煤等； 常規(guī)難制樣的樣品，如橡膠、高聚物等； 可采用光聲光譜法。 也可采用調(diào)糊法，將研細(xì)的樣品用氟化煤油或重?zé)N油調(diào)糊，夾在兩鹽片間測(cè)定。 A = ? b c (一 )、色散型紅外光譜儀 基本結(jié)構(gòu) 光源 吸收池 單色器 檢測(cè)器 光源 參比 樣品 單色器 檢測(cè)器 三 紅外光譜的儀器 主要部件 （ 1）光源 ——Nernst燈 ——炭化硅棒 ——涂有稀土化合物的 NiCr螺旋燈絲 30mm 12mm ZrO2 ThO2 Y2O3 室溫不導(dǎo)電 加熱到 7000C開始導(dǎo)電，同時(shí)產(chǎn)生連續(xù)紅外輻射 工作溫度： 17500C （ 2）單色器 可采用棱鏡和光柵 為了使波長(zhǎng)范圍增寬，通常可采用幾塊光柵 由于紅外輻射的強(qiáng)度低，狹縫不能太窄，因此單色性差 ? 200 很強(qiáng) ? =75200 強(qiáng) ? =2575 中 ? =525 弱 ? 5 很弱 （ 3）檢測(cè)器 熱檢測(cè)器 ——熱電偶等 光檢測(cè)器 ——InSb、 InAs、 PbSe等半導(dǎo)體材料 受光照射后導(dǎo)電性變化而產(chǎn)生信號(hào) 光檢測(cè)器的靈敏度比熱檢測(cè)器高幾倍，但需要液氮冷卻。其原因是： 主要缺點(diǎn)： 光源強(qiáng)度弱，測(cè)量精度低； 光譜通帶寬，吸收線窄，偏離吸收定律； 紅外吸收池光程短，紅外吸收弱，靈敏度低； 樣品吸收峰多，難找到不受干擾的吸收峰。 939cm1的寬吸收峰對(duì)應(yīng)于 OH面外彎曲振動(dòng)。 （ 3） 1402 cm1為 COH 的面內(nèi)彎曲振動(dòng)。 對(duì)照?qǐng)D ，其余吸收峰的指認(rèn)為： （ 1） 1460cm1處的吸收峰為 CH2(也有 CH3的貢獻(xiàn) )的 CH彎曲振動(dòng)。 （ 5） 720cm1的 CH彎曲振動(dòng)吸收說明 CH2的數(shù)目應(yīng)大于 4，表明該分子為長(zhǎng)鏈烷基羧酸。 （ 4）疊加在羥基峰上 2920cm1， 2850cm1為 CH2的吸收，而2960cm1為 CH3的吸收峰。 （ 3） 33002500cm1的強(qiáng)而寬的吸收表明分子中含有羥基，且形成氫鍵。 [解 ] （ 1） 由其分子式可計(jì)算出該化合物的不飽和度為 1，即該分子含有一個(gè)雙鍵或一個(gè)環(huán)。目前已建立有紅外譜圖的數(shù)據(jù)庫(kù)方便檢索。 （ 4）進(jìn)一步的確認(rèn)需與標(biāo)樣、標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照及結(jié)合其它儀器分析手段得出的結(jié)論。如果是芳香族化合物，應(yīng)定出苯環(huán)取代位置。 （ 2）由分子式計(jì)算不飽和度 U。以長(zhǎng)鏈 CH2為例， 29 2850、 1470、 720 cm1處都應(yīng)出現(xiàn)吸收峰。所以，只有當(dāng)幾處應(yīng)該出現(xiàn)吸收峰的地方都顯示吸收峰時(shí)，方能得出該官能團(tuán)存在的結(jié)論。以締合羥基、締合伯胺基及炔氫為例，它們的吸收峰位只略有差別，但主要差別在于峰形：締合羥基峰寬、圓滑而鈍；締合伯胺基吸收峰有一個(gè)小小的分叉；炔氫