【正文】 E + O2 ??? [氧化 熒光素 ]* + AMP+CO2 + H2O [氧化 熒光素 ]* ??? 氧化 熒光素 + h? 最大發(fā)射波長(zhǎng) 562nm； 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 72 生物發(fā)光分析應(yīng)用 2 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)在細(xì)菌中的黃素酶作用下，在氧化型黃素單核苷酸 (FMA)存在下，發(fā)生發(fā)光反應(yīng) ： NADH + FMA + H+ ?????? NAD+ + FMNH2 NADH脫氫酶 FMNH2 + RCHO + O2 ???? FMN + RCOOH + H2O + h? 黃素酶 最大發(fā)射波長(zhǎng) 495 nm； 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 73 二、 特點(diǎn) characteristics 1. 靈敏度極高 例：熒光素酶和磷酸三腺甙 (ATP)的化學(xué)發(fā)光分析 ， 可測(cè)定 2?1017mol/L的 ATP， 即可檢測(cè)出一個(gè)細(xì)菌中的 ATP含量 2. 儀器設(shè)備簡(jiǎn)單 不需要光源 、 單色器和背景校正； 3. 發(fā)射光強(qiáng)度測(cè)量無(wú)干擾 無(wú)背景光 、 散射光等干擾； 4. 線性范圍寬 5. 分析速度快 缺點(diǎn)： 可供發(fā)光用的試劑少；發(fā)光反應(yīng)效率低 （ 大大低于生物體中的發(fā)光 ） ；機(jī)理研究少 。 E +Mg ppi + 2H+ pH7 8 復(fù)合物與氧反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光： AMP 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 71 生物發(fā)光分析應(yīng)用 1 在 pH 7～ 8，熒光素酶 (E)和 Mg2+的存在下， 熒光素(LH2)與磷酸三腺甙 (ATP)的反應(yīng)，生成磷酸腺甙 (AMP)熒光素和熒光素酸的復(fù)合物和鎂的焦磷酸鹽 (ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ ???? AMP （ 2） 可檢測(cè)低至 109 mol/L 的 H2O2； （ 3） 間接測(cè)定某些生物試樣 氨基酸 + O2 ????? 酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖 + O2 + H2O ????? 葡萄糖酸 + H2O2 通過(guò)測(cè)定生成的 H2O2 ，確定 氨基酸、葡萄糖 含量。 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 69 5. 化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用 （ 1） 該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測(cè)定這些金屬離子。 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 68 （ 3） 液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 機(jī)理研究較多，在分析中應(yīng)用最多；可測(cè)痕量的 H2O2 、Cu、 Mn、 Co、 V、 Fe、 Cr、 Ce、 Hg、 Th等。 此法可用于測(cè)定空氣中 NOx的總量，可與 GC聯(lián)用，作為氮化合物的檢測(cè)器。 第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光分析法 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 58 S0S1S0T1T2碰撞失活系間跨越內(nèi)部轉(zhuǎn)換磷光熒光Y*X化學(xué)激發(fā)光致發(fā)光非輻射躍遷Y Y井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 59 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 60 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 61 化學(xué)效率： emcecl ??? ??? 參加反應(yīng)的分子數(shù)發(fā)射光子的分子數(shù)參加反應(yīng)分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù)?ce?發(fā)光效率： 激發(fā)態(tài)分子數(shù)產(chǎn)生光子數(shù)?em?時(shí)刻 t 的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度 (單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù) )： ? ? tctI ddclcl ?? ?dc/dt 分析物參加反應(yīng)的速率； 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 62 在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對(duì)于發(fā)光試劑小得多，對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)： ? ? cttcttIA tt ????? ?? cl0cl0 cl dddd ?? dc/dt =Kc； K 為反應(yīng)速率常數(shù)。 ? 固體基質(zhì)表面室溫磷光分析 ? 膠束穩(wěn)定室溫磷光分析 ? 敏化室溫磷光分析 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 55 室溫磷光分析應(yīng)用 （ 1） 稠環(huán)芳烴分析 采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測(cè)定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物 （ 致癌物質(zhì) ） （ 2） 農(nóng)藥 、 生物堿 、 植物生長(zhǎng)激素的分析 煙堿 、 降煙堿 、 新煙堿等分析 檢測(cè)限 ?g/cm3 （ 3） 藥物分析和臨床分析 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 56 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 57 一、 基本原理 1. 化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中 ， 某些化合物接受能量而被激發(fā) ， 從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí) ， 發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光 。 鈹 、 鋁 、 硼 、 鎵 、 硒 、 鎂 、 稀土常采用熒光分析法； 氟 、 硫 、 鐵 、 銀 、 鈷 、 鎳采用熒光熄滅法測(cè)定； 銅 、 鈹 、 鐵 、 鈷 、 鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定； 鉻 、 鈮 、 鈾 、 碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定； 鈰 、 銪 、 銻 、 釩 、 鈾采用固體熒光法測(cè)定 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 50 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 51 (2)生物與有機(jī)化合物的分析 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 52 低溫磷光分析法 ? 低溫磷光分析是將試樣溶于有機(jī)溶劑中，在液氮（溫度 77K）條件下形成剛性玻璃狀物后，測(cè)量磷光 .這樣，可減小分子間的碰撞，防止磷光猝滅 .所用的溶劑應(yīng)具備下列條件： ? ①易于制備和提純； ②能很好的溶解被分析物質(zhì)； ③在 77K溫度下應(yīng)有足夠的粘度并能形成明凈的剛性玻璃體； ④在所研究的光譜區(qū)背景要低，沒(méi)有明顯的光吸收和光發(fā)射現(xiàn)象。 （ 2） 選擇性強(qiáng) 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜 ， 又可根據(jù)特征吸收光譜； （ 3） 試樣量少 缺點(diǎn) ：應(yīng)用范圍小 。 室溫測(cè)量時(shí) ， 不需要杜瓦瓶 。 測(cè)量方法： （ 1） 通常借助于熒光和磷光壽命的差別 ， 采用磷光鏡的裝置將熒光隔開 。 1→ 4 1→ 3 1→ 2 1→ 1 1 → 4 1 → 3 1 → 2 1 → 1 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 38 2. 三維熒光光譜 I F ∝ f (λex 、 λem) 蒽的激發(fā)光譜 固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描激發(fā)波長(zhǎng) 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 39 I F ∝ f (λex 、 λem) 蒽的發(fā)射光譜 固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng) 井岡山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院