實(shí)驗(yàn)課-制藥工程生化原理與制備實(shí)驗(yàn)指doc(參考版)
2025-07-18 04:38本頁(yè)面
【正文】 （3）有大量脂肪性物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混合物，這時(shí)可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液再測(cè)定。30min后，可有霧狀沉淀發(fā)生。五 注意事項(xiàng)（1）本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定范圍1－10mg蛋白質(zhì)?！?】奶粉中蛋白含量的測(cè)定準(zhǔn)確吸取9 ml配制好的液態(tài)牛奶于10ml離心管中， 5000 r／min下離心10min，收集上清。 儀器：試管，試管架，燒杯，玻璃棒，比色皿，容量瓶，試劑瓶，721 分光光度計(jì) 四 實(shí)驗(yàn)步驟【1】標(biāo)準(zhǔn)啦線(xiàn)繪制， ， ml雙縮脲試劑．混勻，室溫下反應(yīng)30min．然后用721分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定吸光值。 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：利用此法測(cè)定奶粉中的蛋白含量，最后以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。配好后貯于塑料瓶中。4H2O)6 g。三 試劑與儀器 試劑： 奶粉的配制：。思考題： 1. DNA含量檢測(cè)對(duì)生物藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)的意義？ 實(shí)驗(yàn)四 雙縮脲法測(cè)蛋白質(zhì)的測(cè)定一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆针p縮脲法測(cè)量蛋白質(zhì)含量的原理和方法；了解離心機(jī)的使用。實(shí)驗(yàn)后請(qǐng)清理實(shí)驗(yàn)桌面，帶走自己的實(shí)驗(yàn)物品。5.電泳時(shí)，使用TAE的工作濃度為1X。模具及梳子請(qǐng)放回盤(pán)內(nèi)，勿隨意散放在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)。3.l足夠。l，每50ml凝膠不超過(guò)2181。2.六 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.五 對(duì)比試驗(yàn)酵母組DNA提取【1】10ml菌液過(guò)夜培養(yǎng)至飽和（OD600值為23） 【2】離心沉降細(xì)胞（Sorvall中以2000rpm的速度），然后以冷的、等體積的無(wú)菌蒸餾水洗滌 【3】將細(xì)胞沉淀在200μl 裂解緩沖液中重懸浮，然后加入約300μl 玻璃珠和200μl的1：1苯酚：氯仿混和液 【4】漩渦搖勻12min 【5】加入200μl的 TE緩沖液，倒置混合610次?！?2】加10ulTE緩沖液, 5ul 10mg/ml的RNAase(RNA酶)，溶解質(zhì)粒DNA，充分混勻?！?0】加入500ul 70%乙醇，混勻，8000rpm離心2分鐘?！?】 向上清液中加入800ul無(wú)水乙醇，混勻后，12500rpm離心10分鐘。 【6】12500 rpm，4℃，離心15分鐘，取上清液（約400ul），注意不要取到沉淀。（此時(shí)溶液應(yīng)非常粘稠，打開(kāi)蓋時(shí)可拉出絲，如果不能，質(zhì)粒就提不出）。取沉淀，重懸于100μl溶液Ⅰ（預(yù)冷的），用移液槍吹打至完全分散（必須充分混勻）?！?】，4℃，12500 rpm離心1分鐘收集菌體。 儀器：水平電泳槽，穩(wěn)壓穩(wěn)流高壓電泳儀，紫外分析儀，離心機(jī)，滅菌鍋，恒溫振蕩搖床，移液槍?zhuān)瞧?。YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，加水至1L，高壓121度20min，滅菌后加入葡萄糖20g。固體培養(yǎng)基向液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂糖。待膠溶解好后加入5ulEB，搖勻，倒入插好梳子的制膠模具中。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。10TAE緩沖液 ?Ac, 6凝膠加樣緩沖液 50%甘油，, %溴酚藍(lán)裂解緩沖液：10 mmol/L TrisHCl ，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA pH 。溶液Ⅲ：5mol/L乙酸鉀 60ml、 、。另外，一些低熔點(diǎn)的瓊脂糖在62 ℃時(shí)熔化，因此其中的樣品(如DNA)，可以在加熱到熔點(diǎn)的水浴中放置一段時(shí)間，重新溶解到溶液中而回收。瓊脂糖也適合DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過(guò)中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。 瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過(guò)瓊脂糖的最初濃度來(lái)控制，低濃度的瓊脂糖形較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。 瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的，是由D半乳糖和3,6脫水L半乳糖連接而的一種線(xiàn)性多糖?！?，線(xiàn)性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈相互盤(pán)旋，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。l 掌握利用溴化乙錠（EB）在紫外下檢測(cè)DNA的原理。l 掌握提取質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中的各項(xiàng)基本技術(shù)。3. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。2. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)待測(cè)樣品相對(duì)遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其分子量。（六）染色與脫色先用固定液將凝膠固定1小時(shí)，再將染色液倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，染色40min左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)遷移率。（五）凝膠板剝
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