【正文】 。 2. 為避免孔內(nèi)液體蒸發(fā)，可用封板膠將 ELISA板面密封后進行溫育。 B/B0 酶聯(lián)吸附測定標準牛 IgG標準曲線 y = + R2 = 10120 1標準牛IgG含量對數(shù)值【 注意事項 】 1. 使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。其中， C為標準牛 IgG含量；B為不同濃度標準牛 IgG吸收值與 0%吸收值之差 。 8. 數(shù)據(jù)處理。 7. 吸收測定。 6. 加人 OPD底物。 5. 加人 HRP標記的羊抗兔 Ig G。將標準牛 IgG和兔抗牛血清的混合物取 100μL加入到酶標板孔內(nèi)，同是 4個未加抗原的 100%值的平行樣也加入酶標板中。封閉后，如前述洗滌。 3. 封閉板。 將標準 IgG（ 10mg/mL） 用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標準牛 IgG（ 4μg/mL至 ） 各200μL， 加到入 32倍稀釋好的 200μL的兔抗牛血清中 ，其中 4個不加標準牛 IgG作為測量時的 100%值 。 取標準 IgG（ 10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋 ， 得到濃度為 液 ， 每孔加人 100μL抗原包被液 ， 并以不加標準抗原的兩孔為對照 ， 為反應(yīng)的 0%值 ， 將反應(yīng)板于 4℃ 過夜 （ 8個樣品 ， 分 3個平行 ， 4個 100%值孔；共 28+2孔 ） 。于 500mL蒸餾水中加入 98%濃硫酸 76mL混均即可。12H2O ,檸檬酸 100mL蒸餾水中 , 再加入 40mgOPD， 40μL30%H2O2。 (4)封閉液：含 %明膠 ， 。12H2O , Tween— 20， 。 (3)稀釋液與洗滌液： Tween20, ４ ℃ ，保存。 【 儀器、材料與試劑 】 1. 儀器設(shè)備 酶聯(lián)免疫檢測儀 (Bio－ 550)；酶標板 (96孔 )；微量注射器。 ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體 , 再加 相應(yīng)酶標記抗體，生成抗原 待測抗體 酶標記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。 ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測杭原。 【 思考題 】 ？ Tm值？有何用途？如何計算？ ？ 實驗八 酶聯(lián)免疫吸附實驗 【 實驗?zāi)康?】 掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗的一般原理，掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗的基本操作及其在生物樣品測定中的應(yīng)用。 2. Mg2+ 對 TaqDNA聚合酶的活性影響很大，有時按照試劑商提供的說明擴增不出目的基因時，不妨適當增加 Mg2+的濃度。電泳結(jié)束后， EB染色 15min，紫外燈下觀察實驗結(jié)果，必要時拍照。L反應(yīng)液及 1181。L 2. 在 PCR儀上設(shè)置如下程序進行擴增 ① 94 ℃ 預(yù)變性 5min； ② 94 ℃ 變性 1min； ③ 54 ℃ 退火 1min； ④ 72 ℃ 延伸 1min； ⑤ 重復(fù)步驟②～④，約 3035次； ⑥ 72 ℃ 延伸 10min； ⑦ 20 ℃ 保溫 1min。g Taq DNA聚合酶 181。L～ 10 181。mol/L primer 2(下游 ) 181。L 181。L 每種 10 181。 成分 體積 終濃度 10 PCR buffer 5 181。 【 實驗步驟 】 1. 分別在兩個滅菌的 ，按加樣表的順序加樣（整個加樣過程 TaqDNA聚合酶放于冰中保持低溫），建立50181。 2. 5 溴酚藍上樣緩沖液。 典型的 PCR反應(yīng)體系由如下組分組成： DNA模板、反應(yīng)緩沖液、 dNTP、 MgCl兩個合成的 DNA引物、耐熱 Taq DNA聚合酶。 上述 3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸 3個階段。 2. 退火：使溶液降溫至 50～ 60 ℃ ，模板 DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，即退火階段。在待擴增的 DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增 2n倍。 3. 掌握 PCR的基本操作。 實驗七 PCR擴增目的基因片段 【 實驗?zāi)康?】 1. 通過本實驗學(xué)習 PCR反應(yīng)的基本原理。 【 實驗安排 】 本實驗一天內(nèi)可做完。 20ulTE緩沖液，其中含有 20ul/ml的胰RNA酶，使 DNA完全溶解， 20攝氏度保存。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。 8. 向上清中加入等體積酚：氯仿（ 1： 1），反復(fù)混勻， 12022r/min，離心 5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 7. 12022r/min。 5．加 200ul溶液，蓋緊管皿，混勻內(nèi)容物，將離心管放在冰上 5分鐘。 3. 吸去培養(yǎng)液，使細胞沉淀盡可能干燥。 7. 凝膠加樣緩沖液 (6x)： 40%蔗糖、 %溴酚藍 8. 酚 【 實驗步驟 】 （一）提取質(zhì)粒 1. 將 2毫升含相應(yīng)抗生素的 LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入上述的含 puC19質(zhì)粒的大腸桿菌， 37攝氏度振蕩培養(yǎng)過夜。當加入 pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體 DNA與不穩(wěn)定的大分子 RNA，蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。 【 實驗原理 】 堿裂解法去、提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體 DNA在拓撲學(xué)上的差異來分離它 們。 5. 在變性液中加入 2％ Triton X－ 100以保證蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如 CHAPS和 Zwittergent3－ 14等兩性離子去垢劑。 3. 通常，窄范圍的 pH梯度可以提高分辨率，但是需要時間也比較常， pH梯度范圍為 2是較好的選擇。如用考馬斯亮藍 R250染色，加樣量可為 50150?g；如用銀染色，加樣量可減少到 1?g。為防止上述影響，進行 IEFPAGE時，樣品應(yīng)透析或用 SephadexG25脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。 （ 2）待測蛋白樣品等電點的計算： ①按下列公式計算蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠正極端的實際長度（ Lp表示）： Lp=lp l1 / l2 式中 lp—— 染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶中心至凝膠正極端的長度 l1—— 凝膠固定前的長度 l2—— 凝膠染色后的長度 ②根據(jù)上式計算待測蛋白的 Lp，在標準曲線上查出所對應(yīng)的 pH，即為該蛋白的等電點。 結(jié)果測定： （ 1） pH梯度曲線的制作：以膠長（ mm）為橫坐標，各區(qū)段對應(yīng)的 pH的平均值為縱坐標，在坐標紙上作圖，可得到一條近似直線的 PH梯度曲線。 5. pH梯度的測量：在未固定前將凝膠縱切為兩部分 ， 一部分用于進行第四步 ， 另一部分 （ 三條泳道即可 ） 按從正極端向負極端的順序切成 的區(qū)段 ， 按次序放入有標號的 、 裝有 1ml蒸餾水的試管中 ， 浸泡過夜 ， 然后用精密 pH試紙測出每管浸泡液的 pH并記錄 。 量取并記錄漂洗后的膠長 。 3. 剝膠：電泳結(jié)束后，取下膠塊，分別于正負兩極做上標記，切不可弄混，并測量出凝膠的長度。 2. 電泳：吸去凝膠表面上的水層，于電泳槽正極緩沖液加入 %的硫酸（或磷酸），負極加入%的乙二胺（或乙醇胺 /或 NaOH）。 然后加入 Ampholine、 IgG待測樣品和 TEMED溶液 ， 混勻后立即制膠 （ 方法同 SDSPAGE電泳 ） ， 膠液加至距離頂部 5mm處 ， 在膠面上覆蓋 3mm厚的水 ， 應(yīng)注意不要讓水破壞膠的表面 ，室溫下放置 20~30min即可聚合 。 【 實驗步驟 】 凝膠制備：按下表配制 %凝膠。使用時取 93ml，加入 ，搖勻即可使用。 (NaOH10g配成 500ml) 7．固定液： 10%(W/V)三氯乙酸。 5．正極緩沖液： %(V/V)硫酸或磷酸。 2. 丙烯酰胺（ Acr）溶液： Acr 30g ，甲叉雙丙烯酰胺（ Bis） ，蒸餾水溶解后定容至 100ml，過濾， 4℃ 保存。 電泳后測定其各種蛋白質(zhì) “ 聚焦 ”部位的 pH， 即可得知它們的等電點 。 據(jù)此 ， 在電泳系統(tǒng)中創(chuàng)造一個由陽極向陰極 ， pH由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定 pH梯度環(huán)境 ， 那么處在這種系統(tǒng)中具有不同等電點的各種蛋白質(zhì) ， 將根據(jù)所處環(huán)境的pH與其自身等電點的差異 ， 分別帶上正電荷或負電荷 ， 并向與它們各自的等電點相當?shù)?pH環(huán)境位置處移動 ， 當?shù)竭_該位置時即停止移動 ， 從而各自焦聚 （ 聚焦 ） ， 分別形成一條集中的蛋白質(zhì)區(qū)帶 。 【 實驗原理 】 蛋白質(zhì) （ 酶 ） 、 多肽等兩性電解質(zhì) ， 其所帶電荷的數(shù)量與性質(zhì) ， 隨所處環(huán)境的 pH而變化 。 【 思考題 】 1. 在不連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,當分離膠加完后 ,需在其上加一層水 ,為什么 ? 2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用 ? 3. 在不