【正文】 參考文獻。找出該物質(zhì)確定其成分及作用機理與量效關(guān)系預計在不 遠的將來即可變?yōu)楝F(xiàn)實。隨著3uHPL高效分離柱的逐漸普及利用高效液相色譜分離測定紅曲霉菌發(fā)酵 產(chǎn)物中Monacolin類化合物的方法將得到更為廣泛的應用。這類藥物的發(fā)現(xiàn)是長期以來尋找降血脂藥物研究的一個突破性進展。我們不僅在改變紅曲霉生長環(huán)境和條件那些方面做努力，我們也在分子方面做努力，作為紅曲霉產(chǎn)生Monacolin K的理論依據(jù)，也許以后，通過我們對表達基因的鑒定，通過基因工程技術(shù)我們會實現(xiàn)更大的成就。 第四章 結(jié)論與展望 結(jié)論本次試驗，通過統(tǒng)計觀察，我們發(fā)現(xiàn)了紅曲霉代謝產(chǎn)物Monacolin k較多是在其生長末期，也就是10天以后，但是那個階段紅曲霉的其他代謝產(chǎn)物也很多，對我們進行提取RNA造成很大的麻煩，所以我們選擇了提取紅曲霉種子液的RNA，也就是紅曲霉生長初期是的RNA，開始的時候我們可以提取到RNA，但是多次進行，逆轉(zhuǎn)錄，然后PCR最后得到的DNA不成功，我們分析也許那個時間的紅曲霉因為不產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物所以其那段目的基因不表達。⑧ 樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小、提取量也下降。⑥ 瓊脂糖凝膠取出后，一定要將原來的垃圾袋扎好，換上新的，將垃圾扔到指定地點。④ 凡是用氫氧化鈉泡過的瓶子，一定要用DEPC水沖洗一下。② 液氮研磨菌液之前一定要帶好厚的橡膠手套，以免被液氮凍傷。⑤ 平板和錐形瓶養(yǎng)菌完后，一定要及時清洗，以免菌造成一些難聞的氣味或者對別人帶來不便。③ 在超凈工作臺進行到培養(yǎng)基或者接種嚴格按照無菌操作規(guī)范進行。 注意事項 培養(yǎng)菌中的相關(guān)事項① 培養(yǎng)基和一些實驗器具在用之前必須經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌處理。溫度時間95℃5min94℃30sec47℃30sec72℃90min72℃10min第三章 實驗結(jié)果與分析 實驗結(jié)果 菌落形態(tài)觀察平板固態(tài)培養(yǎng)基菌落：液態(tài)培養(yǎng)基菌落： 菌種生長曲線 通過測定數(shù)據(jù)得到下圖菌絲體重量隨著時間變化 莫納克林K代謝情況液態(tài) (E15+36251)/31684*4M—1 代謝曲線 代謝產(chǎn)物為莫納克林K 紅曲霉DNA Pcr擴增瓊脂糖凝膠熒光觀察（mokf和mokh）左邊為mokf 右邊為mokh有一條清晰地條帶證明目的基因mokf和mokh的存在此圖：紅曲霉DNA瓊脂糖凝膠下熒光觀察結(jié)果 紅曲霉種子液RNA提取結(jié)果 RNA在瓊脂糖凝膠熒光觀察結(jié)果三條清晰的條帶證明提取RNA成功，可以進行下面逆轉(zhuǎn)錄和Pcr擴增實驗 實驗結(jié)果分析 本次試驗通過觀察紅曲霉的生長情況以及其代謝情況，了解到在培養(yǎng)七天左右時其生長速度最快，代謝速率快，到了生長末期代謝物增多，但是不僅莫納克林K產(chǎn)量多，其它的代謝物也很多，干擾結(jié)果，在那些時間段提取RNA難度較大，不易成功，最終確定為在種子液后期提取RNA成功幾率很大，而且干擾代謝產(chǎn)物少。to339。 PCR擴增逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA PCR擴增體系25ul試劑用量10xEXTap BufferdNTP mix2ul上游引物1ul下游引物1ulcDNA模板1ulEx Tap 酶滅菌水按順序?qū)⑸鲜鑫锛拥紼P管中，然后將EP管放到PCR擴增儀中在設計程序條件下擴增。 gDNA去除反應體系5gDNA Buffer2ulTotal RNA、（ul）梯度RNA seFree ddH2O補足到10ul 反轉(zhuǎn)錄反應體系試劑使用量10Fast RT Buffer2ulRT Enzyme Mix1ulFQRT Primer Mix2ulRNA seFree ddH2O補足到10ul將反轉(zhuǎn)錄反應的Mix（）加到gDNA()去除的反應體系中，充分混勻。（建立20ul反應體系）將模板RNA在冰上解凍：5gDNA Buffer、FQRT Primer Mix、10Fast RT Buffer、RNA seFree ddH2O 室溫解凍，解凍后迅速放于冰上，使用前將菌種溶液渦旋震蕩混勻，簡短離心收集殘壁液。 ⑥、離心12000rpm，5min，4℃，小心吸進乙醇，將兩管開口放于冰上干燥。④、 兩管繼續(xù)取上清液加入兩只EP管中，一只管300ul，另一只250ul，分別向兩只管中加入與上清液等量的異丙醇，輕輕顛倒混勻，靜置十分鐘。②、兩根管分別加入200ul氯仿，劇烈震蕩15s，放置3min，離心12000rpm，15min，4℃。實驗臺和重要設備準備工作：用配制好的乙醇溶液配合脫脂棉擦拭試驗臺和各種需要的儀器等（每次操作需要用酒精擦拭手和槍），將NaOH泡后的錐形瓶和量筒再用DEPC水清洗一下，注意節(jié)約，最后用NaOH泡電泳槽。儀器處理：（接下來必須戴手套，戴口罩，穿實驗服）將滅菌的儀器和溶液帶到實驗室，然后用滅菌后的NaOH溶液浸泡一下四個250ml錐形瓶和一個100ml量筒30分鐘（節(jié)約使用NaOH溶液）。配制NaOH溶液：500ml超純水和10gNaOH加入500ml錐形瓶中，用鋁箔紙封口。DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50 ug/ml雙鏈DNA、40 μg/ml單鏈DNA。DNA濃度及純度檢測得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。；且DNA產(chǎn)物應保存在20℃，以防DNA降解。（注意：洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小影響回收效率。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂液。l 漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm(~13,400g )離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。l緩沖液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm(~13,400g )離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。l左右，可分次加入離心。⑤ 將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12,000 rpm (~13,400g ) 離心30 sec，棄掉廢液。（注：若提取富含多酚或淀粉的植物組織，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1進行等體積抽提）④ 小心地將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入700 181。③ 加入700 181。② 將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預先裝有700 181。 DNA的提取及檢測 DNA操作步驟使用前請先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。在菌種生長中后期定時取液測其代謝產(chǎn)物莫納克林K的含量，記錄數(shù)據(jù)繪制它的代謝曲線。將接種好的培養(yǎng)皿倒置放入25 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中進行倒置靜止培養(yǎng)，期間然后進行菌落形態(tài)觀察（十天左右）。待培養(yǎng)基冷卻變?yōu)楣虘B(tài)時進行接種。用紫外線滅菌燈對超凈工作臺及實驗器材進行20 min的充分滅菌。蛋白胨1%、%、%紅曲霉斜面培養(yǎng)基：1000ml/500ml蒸餾水、葡萄糖2%、%、%、麥芽精粉2%、瓊脂2%（一般會多放點瓊脂讓培養(yǎng)基硬度好一點）、%、%、% 主要儀器表儀器名稱生產(chǎn)廠家儀器型號電子稱佛山市偉仕達電器實業(yè)有限公司TVKS303干式恒溫器北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司HZLY1001離心機美國熱電公司MICRO 17R智能電熱恒溫鼓風干燥箱上?，槴\實驗設備有限公司HW500AS超凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司SWCJ1FD水平電泳儀北京六一儀器廠DYY10C冰箱新飛河南新飛電器有限責任公司BCD252CKX高效液相色譜儀日本島津公司SIL20A雪花制冰機北京長流科學儀器公司FM50酶標儀美國分子儀器公司Spectra Max i3滅菌鍋日本三洋電器集團MLS3750全溫振蕩培養(yǎng)箱江蘇太倉市實驗設備廠HZQF160PCR 擴增儀德國Biometra公司Hema240/360凝膠成像儀美國GE公司BGgdsAUTO(130) 實驗藥品表藥品名稱藥品級別生產(chǎn)廠家麥芽浸出粉分析純國藥集團化學試劑有限公司酵母提取物分析純OXOID LTD,BASINGSTOKE,HAMPSHIRE,ENGLAND蛋白胨分析純北京奧博星生物技術(shù)有限公司磷酸氫二鉀分析純國藥集團化學試劑有限公司七水合硫酸鎂分析純國藥集團化學試劑有限公司硝酸鈉分析純國藥集團化學試劑有限公司葡萄糖分析純天津市光復科技發(fā)展有限公司黃豆粉分析純國藥集團化學試劑有限公司甘油分析純天津市光復科技發(fā)展有限公司瓊脂分析純天津市光復科技發(fā)展有限公司瓊脂糖分析純天津市光復科技發(fā)展有限公司Trizol RNA分析純天根生化科技有限公司液氮分析純天根生化科技有限公司DEPC分析純天根生化科技有限公司氯仿分析純天根生化科技有限公司異丙醇化學純天根生化科技有限公司NAOH分析純天根生化科技有限公司TAE分析純天根生化科技有限公司5gDNA Buffer分析純TaKaRa公司Total RNA分析純TaKaRa公司RNA seFree ddH2O分析純TaKaRa公司10Fast RT Buffer分析純TaKaRa公司RT Enzyme Mix分析純TaKaRa公司FQRT Primer Mix分析純TaKaRa公司10xEXTap Buffer分析純TaKaRa公司dNPT Mix分析純TaKaRa公司上游引物分析純TaKaRa公司下游引物分析純TaKaRa公司EX Tap酶分析純TaKaRa公司EB分析純天根生化科技有限公司乙醇分析純天根生化科技有限公司 實驗方法 菌種培養(yǎng)配制培養(yǎng)基 根據(jù)每種培養(yǎng)基中藥品的使用比例進行稱量配制，將配置好的培養(yǎng)基和所需培養(yǎng)皿一起放入立式壓力蒸汽滅菌器，在121 ℃條件下滅菌20 min。第二章 實驗材料與方法 實驗材料 實驗所用菌種：紅曲霉培養(yǎng)基合成與殺菌，培養(yǎng)基倒平板，平板培養(yǎng)基的無菌接種得到的各代菌液，試管斜面培養(yǎng)基的無菌接種種子液培養(yǎng)基合成與殺菌，接種紅曲霉后得到各代菌種。同時，努力完善紅曲的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，積極開發(fā)紅曲保健產(chǎn)品，以促進紅曲產(chǎn)業(yè)向縱深發(fā)展。通過這些操作，我們得到菌種代謝產(chǎn)生莫納克林K的限制基因和高產(chǎn)基因，對莫納克林K的研究有重大意義，在分子界有重大研究作用，應用代謝工程和遺傳工程技術(shù)定向選育紅曲霉菌種并結(jié)合發(fā)酵工藝的優(yōu)化，以期大幅度提高紅曲產(chǎn)品中活性物質(zhì)的量，將會成為未來的研究重點和熱點。提取成功的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄操作得到cDNA，然后對cDNA進行PCR擴增得到更多的DNA。文獻原文?？偠灾?多響應建模方法被證明是有價值的估計動力學參數(shù)和洞察Monacolin K退化機制的方法。速率常數(shù)的溫度依賴阿倫尼烏斯所描述的關(guān)系。然而,形成內(nèi)酯氧化產(chǎn)品的速度低于酸形式。C。在大氣存儲中有氧化產(chǎn)品形成。多響應動力學建模表明MA真空中轉(zhuǎn)化為DMA和未知化合物在450176。因此,紅曲米粉應儲存在4176。4 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn),MA和ML長期儲存在紅曲米粉特別是在高存儲溫度(40 50176。然后,k值替換成微分方程(Eq(1)和(2))根據(jù)動力學方案每使用一階條件反應,以計算Monacolin K和濃度在存儲dehydromonacolin K。C(廣場)和50176。C(三角形),30176。實驗數(shù)據(jù)符號：4176。圖6，MA的降解動力學模型驗證(a)和ML(b)(串聯(lián)一階動力學)。表3動力學參數(shù)(Ea和K從0開始)monacolin K退化存儲在450176。C()和50176。C(),30176。圖5符合一級動力學模型對實驗數(shù)據(jù)的ML退化(a)(b)和DML，形成期間存儲在大氣的紅曲米粉方案5，仿真和實驗數(shù)據(jù)是實線和符號，4176。更高的降解活化能monacolin K以酸的形式dehydromonacolin K(Ea1)與內(nèi)酯形式(Ea4)表明,退化monacolin K到dehydromonacolin K以酸的形式對溫度的變化更敏感于內(nèi)酯的形式。同時,MA的速率常數(shù)退化在真空和大氣中被用于評估活化能。C),參數(shù)估計的結(jié)果包括Ea和k從0開始見表3?；罨軓膌n k 1 / T回歸分析根據(jù)阿倫尼烏斯方程。表2速率常數(shù)(k)和相關(guān)系數(shù)(R2)ML退化和DML形成在使用一