【正文】 此外，感謝 本實(shí)驗(yàn)室 其他師兄師姐及各同期專題生同學(xué)給予我的照顧與幫助。在此，謹(jǐn)對導(dǎo)師們的辛勤培育和熱情關(guān)懷致以最衷心的感謝。導(dǎo)師們嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，豐富扎實(shí)的理論知識和高度的責(zé)任感深深感染著我。2(9):647656. [14] Harris MH, Thompson CB .The role of the Bcl2 family in the regulation of outer mitochondrial membrane permeability. Cell Death Differ, 2021。 74:49 139. [8] Kolch W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochem J, 2021。 [4] 劉因華 ． 抗腫瘤藥物的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景 [J] ．中國醫(yī)藥指南， 2021年 9月上半月刊， 106。 [2] 黃海華，余立華等 ． 藥學(xué)細(xì)胞生物學(xué) [M] ． 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2021年（ 2）， 454455。實(shí)驗(yàn)結(jié)果若為聯(lián)合用藥作用于其他腫瘤細(xì)胞仍可起到良好的協(xié)同作用并且兩藥合用整體實(shí)驗(yàn)中與單獨(dú)給藥組比較抑瘤作用增 強(qiáng)的話，聯(lián)合給藥對臨床應(yīng)用具有更為重要的意義。 Drug A與 Drug B聯(lián)合用藥是否對 HepG2細(xì)胞具有特異性的協(xié)同作用也需要考察，也就是說，我們還需考察的其他的腫瘤細(xì)胞。 Drug A經(jīng)過不同的細(xì) 胞周期阻滯機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞阻滯在 G0期，細(xì)胞增殖受阻，誘導(dǎo)凋亡。線粒體可以決定細(xì)胞的生存或死亡 [11,12]，接下來我們可以考察兩藥合用是否影響 BclxL， Bcl2,Bax,，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡 [13,14]。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果不但證實(shí)了凋亡存在，而且比較了各組的凋亡發(fā)生程度，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率高于兩單藥組。其次細(xì)胞凋亡過程消耗 ATP。 Drug A與 Drug B聯(lián)合用藥 24h后的 pERK蛋白的表達(dá)明顯被抑制，從而起到殺傷 HepG2細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。而被磷酸化激活的 ERK轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并且通過磷酸化作用，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，最終調(diào)節(jié)包括多種參與細(xì)胞增殖、存活和分化的基因表達(dá) [9]。 眾所周知，所有真核細(xì)胞中均存在 RAF/MEK/ERK級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其通過 Ras、 Raf、MEK及 ERK的特異性級聯(lián)磷酸化將信號由細(xì)胞膜外傳入細(xì)胞核內(nèi) [8]。 MAPKKK對 MAPKK的絲 蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化而將其活化； MAPKK對 MAPK 絲蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化而活化。有絲分裂原激活蛋白激酶（ mitogenactivated protein kinases， MAPKs）是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一組絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶，對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到重要的調(diào)節(jié)作用。 ， Drug A 與 Drug B 聯(lián)合用藥 24h后的 pERK 蛋白的表達(dá)明顯被抑制，但 ERK 蛋白表達(dá)無明顯變化。 A 6μmol/L聯(lián)合 Drug B 100μmol/L協(xié)同作用 24h 最為顯著。mol Drug A,B: 24h for 100181。 SEM of the results for three independent experiments. *P＜ ； **P＜ . 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 14 . 蛋白免疫印跡法細(xì)胞凋亡 蛋白免疫印跡法（ Western blotting analysis）結(jié)果顯示， A與 B聯(lián)合用藥 24h后 的 BAX、 FADD蛋白的表達(dá)增加，但 BCL2蛋白表達(dá)降低（ Fig. 23C）。mol Drug A,B: 24h for 100181。mol Drug B,A+B: 24h for Drug A+B。 Fig. 22A The cellular morphological changes were observed by phase contrast microscopy 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 13 Con:0 h for Drug ,A:24h for 6181。mol Drug B,A+B: 24h for Drug A+B。 Fig. 22A The cellular morphological changes were observed by phase contrast microscopy Con:0 h for Drug ,A:24h for 6181。 SEM of the results for three independent experiments. 3. Drug A 與 Drug B 聯(lián)合用藥 我們用金氏公式求協(xié)同指數(shù)（ Q 值），再進(jìn)行判斷拮抗、相加、協(xié)同效果： Q=E(a+b)/(Ea+EbEaEb) Ea 和 Eb 為單獨(dú)用藥時的抑制率， E(a+b)為聯(lián)合用藥的抑制率， (Ea+EbEa Eb) 為期望合并效應(yīng)； Q 值＜ 為拮抗， Q 值在 ～ 為相加， Q 值＞ 為協(xié)同作用。mol?L1。隨著作用時間的增加沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 11 和劑量的加大， Drug B 對 HepG2 細(xì)胞抑制作用更加明顯。 SEM of the results for three independent experiments. 2. B 時間劑量性的抑制 HepG2 細(xì)胞增殖 我們選擇 MTT 法來考察 培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞 24 后， B 對細(xì)胞的生長抑制作用。mol?L1。隨著作用時間的增加和劑量的加大， A 對 HepG2 細(xì)胞抑制作用更加明顯。 Table 22A 配制電泳分離膠所用溶液 溶液成分 15 ml 凝膠 30 ml 凝膠 10％ 蒸餾水 30 ％ 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED 12 % 蒸餾水 30 ％ 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 9 15 % 蒸餾水 30 ％ 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED Table 22B 配制 Tris甘氨酸 SDS 聚丙稀酰胺凝膠電泳 5%積層膠所用溶液 溶液成分 不同體積（ ml）凝膠液中各成分所需體積（ ml） 4 5 6 8 10 蒸 餾水 30 ％ 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED Table 22C 蛋白質(zhì)電泳應(yīng)用抗體 Antibodies Type of IgG Dilution β actin Mouse monoclonal IgG 1:1000 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 10 ERK rabbit polyclonal IgG 1: 400 PERK BAX BC