【正文】 常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）ethidium bromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。 Polyacrylamide)將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動。二、 基因操作的主要技術(shù)原理1． 核酸的凝膠電泳(Agarose amp。4. 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。 基因工程中常見的名詞:遺傳工程genetic engineering，基因操作gone manipulation，基因克隆gone cloning，重組DNA技術(shù)rebinant DNA technology，分子克隆molecular cloning。 1996 完成了酵母基因組(107bp)全序列測定。 1989 DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小氧Onouse。 1986 GMO首次在環(huán)境中釋放。 1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。 1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。 19751977 、。 1970 。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由質(zhì)粒DNA所決定。 1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F. Jacob和J. Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。 1953 。 1944 . Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。 第五講 分子生物學(xué)研究法一、 重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題； 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達(dá)。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNAprotein復(fù)合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。的磷酸二酯鍵發(fā)起進(jìn)攻。在Group I內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的339。當(dāng)RNA polⅡ轉(zhuǎn)錄過程中碰到受損傷的核苷酸時，TFⅡH能及時啟動核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)，將損傷修復(fù)。dA區(qū)域。寡聚U的存在使雜合鏈的339。 在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈539。 b、不依賴于ρ 因子的終止若終止點上游存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；在終止點前面有一段由48個A組成的序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3‘端為寡聚U。OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。→339。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。dA區(qū)域。寡聚U的存在使雜合鏈的339。在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈539。端沒有兩樣，都是OH基團(tuán)。研究RNA鏈終止時遇到最常見的問題是339?！?39。但是，也存在三個主要不同點：A． 轉(zhuǎn)錄中不需要RNA引物；B．轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一般只用一小段DNA做模板；C．在轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。mRNA，編碼了一個或多個蛋白質(zhì)序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變?yōu)槎嚯闹械陌被嵝畔ⅲ籸RNA，是合成蛋白質(zhì)的工廠核糖體中的主要成份。④ 轉(zhuǎn)座引起的生物進(jìn)化.六、RNA代謝除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA。② 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制轉(zhuǎn)座時發(fā)生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（312bp）、被稱為靶序列的DNA會被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復(fù)的靶序列之間。（posite transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個功能基因兩端時就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。最簡單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion sequence，IS），它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA的復(fù)制。（Direct repair） ㈢、DNA的轉(zhuǎn)座DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。細(xì)胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。2. 堿基切除修復(fù)（BaseExcision Repair）DNA gylcosylases能特異性識別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化產(chǎn)物）并將受損害堿基切除。Yeast replicators長約150dp，有多個保守重復(fù)區(qū)，共有約500個replicators分布于酵母的17條染色體中。Ter的功能主要是由TerTus復(fù)合物（ter utilization substance）來完成的。3. DNA鏈的終止當(dāng)子鏈延伸達(dá)到terminus region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復(fù)制就終止了。前導(dǎo)鏈的合成：由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點附近合成一個1060 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。2. DNA子鏈的延伸主要包括兩個不同但相互有聯(lián)系的事件，即前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。只有當(dāng)oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。整個DNA復(fù)制過程中，只有復(fù)制起始受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控。每六個DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結(jié)合，可在不同方向同時起始DNA的復(fù)制。1. DNA復(fù)制的起始大腸桿菌中的復(fù)制起始位點是Ori C，全長245Bp，該序列在所有細(xì)菌復(fù)制起始位點中都是保守的。OH, 539。DNA polymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。DNA結(jié)合蛋白，使新解鏈的DNA保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Helicase，任何DNA在被復(fù)制前都必須解開雙鏈，這個過程是由helicase來完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開形成單鏈。原核生物的整個染色體上一般只有一個復(fù)制起始位點。㈠、DNA復(fù)制根據(jù)反應(yīng)階段和所需的不同酶類，DNA的復(fù)制可被分為三個階段，即復(fù)制起始、延伸和終止。 五、DNA代謝無論是只含有一對染色體的原核細(xì)胞還是帶有多對染色體的真核細(xì)胞，只有整個基因組得到了完整準(zhǔn)確的復(fù)制，細(xì)胞分裂才能順利發(fā)生。與Ubiquitin相連的蛋白將被送到一個依賴于ATP的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)（Proteasome，Mr. 1106）。每切除一個肽鍵要消耗兩分子ATP。 在大腸桿菌中，許多蛋白質(zhì)的降解是通過一個依賴于ATP的蛋白酶（稱為Lon）來實現(xiàn)的。 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)也存在類似的蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)系統(tǒng)。Importin (α,β亞基)的作用有點像SRP受體。 。受位于ER外膜上的SRPreceptor及ribosomereceptor的牽引，這個復(fù)合物（GTPSRPribosomemRNA新生肽）立即向ER外膜靠攏，并通過peptide transport plex進(jìn)入ER內(nèi)腔。研究發(fā)現(xiàn)，信號肽把Ribosome牽引到ER上。四、蛋白質(zhì)的運輸和降解 絕大部分被運入ER內(nèi)腔的蛋白質(zhì)都帶有一個Signal peptide。有些蛋白質(zhì)必須經(jīng)蛋白酶切割后才有功能。（Addition of Isoprenyl Groups）(prosthetic groups)相結(jié)合；Cytochrome C只有與血紅素（heme）相結(jié)合才有功能。許多蛋白質(zhì)都帶有1530個殘基的signal peptides，負(fù)責(zé)指導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的精確定位。50%的真核蛋白中，N端殘基的氨基酸會被N乙基化。雖然它是氣體，極易擴(kuò)散，但由于它十分活躍，其擴(kuò)散半徑一般只有1mm。˙(Nitric Oxide)。許多重要的神經(jīng)遞質(zhì)都是胺或其次生代謝產(chǎn)物。高等動物不能合成大約一半氨基酸，只能從食物中直接獲取這些必需氨基酸（Essential）。除變構(gòu)抑制之外，GS活性還受共價修飾調(diào)節(jié)。在大腸桿菌中，GS由12個相同的亞基（50kDa）聚合而成，其活性既通過構(gòu)象變化，也能通過共價修飾的方式得到調(diào)節(jié)。1. 銨通過谷氨酸→谷氨酰胺被結(jié)合到有機(jī)物質(zhì)中。1010t，而每年通過硝化細(xì)菌以氣態(tài)氮的形式釋放到大氣中的氮就有2108—5108t。二、氨基酸代謝按所占的質(zhì)量比例計算，N在生物體內(nèi)的重要性排在CHO之后，列第4位。氟脲本身不是thymidylate synthase 抑制劑，但它在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為FdUMP以后，就能直接與TS相結(jié)合并使之失活。如Azaserine和Acivicin都是Glutamine類似物，被用于阻斷核苷酸的生物合成。AD缺失后，細(xì)胞內(nèi)dATP的含量將高達(dá)正常細(xì)胞中的100倍，而過量的dATP則抑制了其余dNTP在T淋巴細(xì)胞中的合成。嘌呤代謝突變會引起重要疾病。nucleotidase）的作用下消去磷酸基團(tuán)，由Adenosinemonophosphate變成Adenosine，或從GMP變成Guanosine。嘌呤核苷酸降解第一步是在539。其中，dTMP（thymidylate）來自于dCDP和dUMP，其直接前體是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate synthase）將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP；反應(yīng)中的甲基來自于N5，N10Methylenetetrahydrofolate。6. 239。CH+提供一個H原子5. 239。位O+基團(tuán)。3. 脫水后，339。2. R1亞基上的SH基團(tuán)為239。位碳原子上的H發(fā)起攻擊，生成339。當(dāng)dTTP與該位點相結(jié)合時，GDP的還原反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。第二個調(diào)節(jié)位點控制了底物特異性。大腸桿菌核苷酸還原酶有兩大特征，它的生物學(xué)活性和底物特異性同時受效應(yīng)子（effector molecules）的影響。這個反應(yīng)很特殊，因為核糖上的還原反應(yīng)發(fā)生于一個沒有活化的碳原子上。5．核糖核苷酸（ribonucleotides）是脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前體。ATP能夠把磷酸基團(tuán)加到其它所有核苷單磷酸上生成核苷三磷酸。這個反應(yīng)需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。參與合成GMP的是③IMP脫氫酶和④XMP谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶 。第十一，脫水環(huán)化，形成嘌呤IMP。第八九，由天門冬酰胺把另一個氨基加到第5位碳原子上。第五，脫水環(huán)化形成咪唑環(huán)。第三，由N10甲基四氫葉酸提供一個甲基。De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP （Phosphoribosyl 1pyrophosphate）這一途徑的第一步是由谷氨酰胺捐獻(xiàn)一個氨基到PRPP的C1位上，生成5phosphoribosylamine。在糖代謝中也有重要作用，如生成UDPG和 CDPdiacylglycerol等。因此，活細(xì)胞內(nèi)時刻進(jìn)行著各種蛋白質(zhì)的合成、修飾、運轉(zhuǎn)和降解反應(yīng)。RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級結(jié)構(gòu)很復(fù)雜；RNA既擔(dān)負(fù)著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉(zhuǎn)錄生成RNA，才能夠得到表達(dá)。 第四講 DNA、RNA和蛋白質(zhì)代謝DNA是貯藏遺傳信息的最重要的生物大分子。氯霉素和嘌呤霉素既能與原核細(xì)胞核糖體結(jié)合，又能與真核生物核糖體結(jié)合，妨礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞生長。羧基端掛了一嘌呤霉素。 嘌呤霉素是AAtRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上，抑制AAtRNA的進(jìn)入。若以poly（U）作模板，則除苯丙氨酸（UUU）外，異亮氨酸（AUU）也會摻入。 蛋白質(zhì)合成的抑制劑 抗菌素對蛋白質(zhì)合成的作用可能是阻止mRNA與核糖體結(jié)合（氯霉素），或阻止AAtRNA與核糖體結(jié)合（四環(huán)素類），或干擾AAtRNA與核糖體結(jié)合而產(chǎn)生錯讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等），或作為競爭性抑制劑抑制蛋白質(zhì)合成。核糖體的移位需要EFG（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。 核糖體向mRNA的3’方向移動一個密碼子，使得帶有第二個氨基酸（現(xiàn)已成為二肽）的tRNA從A位進(jìn)入P位