【正文】 困難及解決辦法： 本課程的作業(yè)及考核依據(jù)之一 我的細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)劃 （手寫和打印均可） 注意事項(xiàng)： 作業(yè)上交時(shí)間及地點(diǎn)： 時(shí)間：校歷第 16周（ ）前 地點(diǎn)： 104館三樓（組胚教研室） 作業(yè)必須標(biāo)明的項(xiàng)目： 題 目 學(xué)號(hào) 姓名 專業(yè) 導(dǎo)師 本課程的作業(yè)及考核依據(jù)之一 OVER 。 我的細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)劃 （手寫和打印均可） 應(yīng)包括如下內(nèi)容： 培養(yǎng)目的： 實(shí)驗(yàn)室條件： 已具備的條件；尚未具備的條件。再放入真空噴鍍儀先后噴鍍碳膜與金或鉑膜，標(biāo)本制備即告完成。乙醇或丙酮脫水后（程序可與超薄切片制備相同），送臨界點(diǎn)干燥器干燥。 終止培養(yǎng)后須充分清洗。 顯示細(xì)胞表面抗原 （略） 顯示細(xì)胞內(nèi)抗原 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 其它電鏡技術(shù) 掃描電鏡技術(shù)： 掃描電鏡技術(shù)（ scanning electron microscopy）可用來觀察培養(yǎng)細(xì)胞的 外部三維形狀 及其 表面的微細(xì)結(jié)構(gòu) ，故無需切片而是力圖保持細(xì)胞的完整性。 旨在對(duì)細(xì)胞表面及內(nèi)部的蛋白質(zhì)、肽等具有抗原性的物質(zhì)進(jìn)行超微定位，亦可進(jìn)行半定量的研究。如細(xì)胞團(tuán)塊較大，可酌情延長固定時(shí)間。 戊二醛固定在室溫條件下進(jìn)行，一般 30 min即可。 鋨酸對(duì)人黏膜損傷尤大，故均應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，于 4℃ 保存。細(xì)胞經(jīng)戊二醛前固定后，對(duì)后固定液的酸堿度等已不敏感。 室溫下約一天方可溶解。 配液前要用酸性洗液浸泡安培數(shù)小時(shí)，再經(jīng)自來水與蒸餾水先后洗滌，然后用磨砂輪劃痕（切勿手觸安培，可用紙巾包裹其一端操作），放入棕色的密封性好的瓶內(nèi)。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標(biāo)本制備 （ 1）固定 : 鋨酸 為淡黃色結(jié)晶， 。 取 A液 19 ml與 B液 81 ml混合，調(diào)節(jié) pH值至 。 B液：取 Na2HPO4 常用的 %戊二醛 （ PB）固定液，配制方法如下： （ 1） (） A液：取 NaH2PO4開瓶后如不一次用完，可在貯存瓶中加少量活性炭，去除氧化物。而鋨酸 (osmic acid)還能夠良好地保存脂類，特別是形成膜結(jié)構(gòu)的脂類，并有電子染色的作用。 常規(guī)使用 戊二醛 鋨酸雙重固定法 。各種液體均須用雙蒸水配制。 由于生長在濾膜的細(xì)胞可從上下兩個(gè)途徑獲取營養(yǎng)，其生長狀態(tài)可能有別于一般貼壁細(xì)胞。 這是理想的培養(yǎng)細(xì)胞的原位包埋法?？膳c細(xì)胞一起包埋切片。 此法能獲得成片細(xì)胞，細(xì)胞形狀保存完好，但超微結(jié)構(gòu)受到一定影響。然后，用吸管吹打約 10 min，使細(xì)胞脫壁成為細(xì)胞懸液。絕大部分細(xì)胞的基底面結(jié)構(gòu)保存完好。 細(xì)胞在瓶內(nèi)原位接受 戊二醛 固定，沖洗后用電烙鐵將培養(yǎng)瓶水平割開，然后用頭端寬扁銳利的 淀帚鏟 (policeman)將細(xì)胞刮下。 細(xì)胞若是生長在軟質(zhì)薄膜上，可原位固定并原位包埋。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 超薄切片技術(shù) 對(duì)培養(yǎng)物的預(yù)處理 對(duì)于在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長的細(xì)胞，可先行原位固定后再收獲細(xì)胞進(jìn)行包埋。 對(duì)培養(yǎng)物的預(yù)處理 （ 1）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的處理 （ 2） 貼壁細(xì)胞的處理 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 超薄切片技術(shù) 對(duì)培養(yǎng)物的預(yù)處理 （ 1）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的處理 終止培養(yǎng)后，首先將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管離心 5min，使之形成既不松散又不過于緊密的細(xì)胞團(tuán)塊，然后像組織塊那樣處理。因此，用電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，用電鏡免疫組織化學(xué)觀察蛋白質(zhì)的超微定位變化、以及應(yīng)用其它電鏡技術(shù)，都可為細(xì)胞的研究提供有價(jià)值的信息。結(jié)果應(yīng)為陰性。結(jié)果應(yīng)為陽性； ④ 用 Southern或 Northern印跡雜交法證明標(biāo)本中含有原位雜交所要檢測的 DNA或 RNA。結(jié)果應(yīng)為陰性； ② 使用 cRNA探針時(shí)，應(yīng)用與靶 mRNA堿基序列相同的同義 RNA探針作對(duì)照。 對(duì)照組應(yīng)使用與實(shí)驗(yàn)組同一批傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 原位雜交技術(shù)主要實(shí)驗(yàn)材料 （ 1） 標(biāo)本的制備 （略） （ 2） 實(shí)驗(yàn)所用器具 （略） （ 3） 溶液配制 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 雜交 （ 1）雜交前處理 （略） （ 2）雜交過程 （略） （ 3）雜交后清洗 （略） （ 4）使用 RNA探針雜交的一般程序 （略） （ 5）使用 DNA探針進(jìn)行雜交的特點(diǎn) （略） （ 6）使用 DNA探針雜交的一般程序 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 顯示標(biāo)記物 半抗原標(biāo)記物的顯示：可按試劑盒說明進(jìn)行。 合成 RNA探針 用標(biāo)記的 三磷酸尿嘧啶（ UTP） ， 合成 DNA探針 用標(biāo)記的 三磷酸胸腺嘧啶（ TTP） 。 單鏈 DNA探針由于 PCR技術(shù)的推廣，其合成與操作均比 RNA探針簡易，應(yīng)用日漸增多。 一般認(rèn)為， RNARNA雜交體的穩(wěn)定性強(qiáng)于 RNADNA雜交體，后者又強(qiáng)于 DNADNA雜交體。 探針與標(biāo)記物的選擇 原位雜交技術(shù)主要實(shí)驗(yàn)材料 雜交 顯示標(biāo)記物 設(shè)立對(duì)照 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 探針與標(biāo)記物的選擇 常用的探針 常用的探針有三種： cRNA探針： DNA探針： 寡核苷酸探針： 前兩者的理想長度是 100個(gè)左右的堿基或堿基對(duì)。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 免疫細(xì)胞化學(xué)的一般問題 免疫細(xì)胞化學(xué)染色的典型程序 （略） （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 免疫細(xì)胞化學(xué) 是在 翻譯水平 檢測基因的表達(dá)結(jié)果（蛋白質(zhì)）， 原位雜交 （ in situ hybridization, ISH)技術(shù) 則是檢測基因的有無及在 轉(zhuǎn)錄水平檢測基因的活性 (mRNA)。 用小分子量的熒光素或生物素標(biāo)記的二抗均比酶標(biāo)者穿透性大，用SPA代替二抗也是一種明智的選擇。常用方法為以去垢劑 Triton X脫去細(xì)胞膜中最主要的成分脂質(zhì)。而 ICC技術(shù)的染色對(duì)象一般為完整的細(xì)胞。估計(jì)抗原含量