【正文】 range, AO）與細(xì)胞內(nèi)的 DNA, RNA都有親和力，但結(jié)合后卻發(fā)不同顏色的熒光， DNA呈亮綠色 ，而 RNA呈橘黃色至火紅色 。 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 常用的顯色標(biāo)記物 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 免疫細(xì)胞化學(xué)的一般問題 免疫細(xì)胞化學(xué)染色的典型程序 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 標(biāo)記物 二抗 一抗 抗原 標(biāo)記物 SPA 一抗 抗原 標(biāo)記鏈親和素 生物素 二抗 一抗 抗原 PAP復(fù)合物 二抗 一抗 抗原 間接法 SPA法 LSAB法 PAP法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理示意圖 間接法 indirect method 過氧化物酶 — 抗過氧化物酶法 peroxidaseanti peroxidase, PAP法 標(biāo)記鏈親和素 — 生物素法 labeled streptoavidin biotin, LSAB法 葡萄球菌蛋白 A法 staphylococal protein A, SPA法 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 間接法 最原始的 ICC技術(shù)是在獲得針對某抗原的特異性抗體后，各實驗室自行對該抗體進(jìn)行標(biāo)記，然后用標(biāo)記抗體直接進(jìn)行免疫染色。 該酶經(jīng)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)而呈色。生物素即維生素 H。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用的顯色標(biāo)記物 辣根過氧化物酶 堿性磷酸酶 用 辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase, HRP）及其它酶（如堿性磷酸酶）作標(biāo)記物的 ICC常稱為 免疫酶方法 。如封固后蓋玻片四周用指甲油（非丙酮溶劑）密封，效果則更好。 其原理是： 使已在抗原位置沉積的金顆粒發(fā)揮催化作用，促進(jìn)銀離子被氫醌（ hydroquinone）還原為銀原子，后者圍繞金顆粒形成一層銀殼；銀殼本身也具有催化作用，使更多的銀離子還原沉積，銀殼便增大，鏡下呈黑色顆粒。 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 ICC與 免疫組織化學(xué) （ immunohistochemistry）的不同之處在于后者要做組織切片，細(xì)胞被切開后，核與胞質(zhì)內(nèi)的抗原暴露于抗體，二者極易結(jié)合。 ISH的原理是： 應(yīng)用帶有標(biāo)記物的已知堿基順序的 核酸探針 與細(xì)胞內(nèi)待測的核酸（ DNA或 RNA）按堿基配對的原則進(jìn)行特異性原位結(jié)合，此即為雜交 ，然后通過對標(biāo)記物的檢測而獲知待測核酸的有無及相對量。應(yīng)用的標(biāo)記物有 放射性核素 以及 半抗原 等。結(jié)果應(yīng)為陽性； ⑤ 使用半抗原標(biāo)記的探針時，應(yīng)設(shè)不加探針進(jìn)行雜交的對照，以證實半抗原的非內(nèi)源性。 對于在玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞或者在蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞，一般先將細(xì)胞消化下來，經(jīng)離心后再固定制片。于 4℃ 離心后固定。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標(biāo)本制備 大部分程序在帶蓋的青霉素小瓶中進(jìn)行。對已貯存長久的戊二醛亦可如此處理。 鋨酸溶解緩慢，至少應(yīng)在使用前 24 h配液。配好的鋨酸固定液如暫不用，可于一 20℃ 凍結(jié)以盡量減少揮發(fā)。 要進(jìn)行掃描電鏡觀察的細(xì)胞最好培養(yǎng)在易于移動的支持物（如蓋玻片、聚苯乙烯薄膜）上。 培養(yǎng)方法： 1）培養(yǎng)基的選用（含應(yīng)補充的附加成分）及培養(yǎng)所需的其它用液； 2）具體操作方法及步驟（按實際操作分步列出）； 3）培養(yǎng)過程的觀察的注意事項； 目的細(xì)胞的鑒定方法： 1）具體方法（可列 1～ 3種）； 2）應(yīng)出現(xiàn)的結(jié)果：陽性；陰性。然后用導(dǎo)電膠將支持物黏在掃描電鏡專配的標(biāo)本臺（注意有細(xì)胞面朝上）。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標(biāo)本制備 （ 1）固定 : （ 2）脫水與置換 ： （略） （ 3）環(huán)氧樹脂包埋法： （略） （ 4）具體操作程序 ： （略） （ 5）超薄切片染色 ： （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 又稱 免疫電鏡技術(shù) (immunoelectronic microscopy)。鋨酸用于后固定。12H 2 O ,加水至 l00ml。戊二醛 (glutaraldehyde）主要用于固定蛋白質(zhì)。 處理時，在 戊二醛 固定后，將其剪成 1mm寬、 2～ 3mm長的適合包埋的小塊。離心后，用鋨酸固定。 超薄切片技術(shù) 電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 其它電鏡技術(shù)簡介 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 超薄切片技術(shù) 制備超薄切片，以透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，是最主要、最基本的電鏡技術(shù)。 常用的對照試驗如下： ① 預(yù)先用 RNA酶或 DNA酶消化靶核酸，然后進(jìn)入正常雜交程序。 但是， RNA易于被環(huán)境中普遍存在的 RNA酶所降解而造成假陰性結(jié)果，因此操作要求十分嚴(yán)格。另一方面是要選擇分子量較小因而穿透性較大的探針。 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 理想的方法應(yīng)是敏感、簡便、快速以及經(jīng)濟，但主要取決于所研究的標(biāo)本及其抗原的分布與含量。 免疫金技術(shù)和免疫熒光技術(shù)一樣，免疫染色后即可于鏡下觀察，無需標(biāo)記物的顯示程序。 異硫氰酸熒光素 （ fluorescein isothiocyanate, FITC)和 四甲基異硫氰酸羅達(dá)明 ( tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）是最常用的熒光素。 由于 1個抗體分子上可結(jié)合多至 150個生物素分子，于是，這類方法的敏感度便大大增強，一抗的稀釋度得以提高。這樣， 1個二抗分子上間接地標(biāo)記了 3個酶分子。 目前，標(biāo)記的二抗已完全商品化。 準(zhǔn)確的溫度和鹽酸濃度，適宜的水解時間是成功的關(guān)鍵。 酸性磷酸酶 葡萄糖 — 6— 磷酸酶 琥珀酸脫氫酶 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 幾種最常用的方法： 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 酸性磷酸酶 酸性磷酸