[醫(yī)藥]第5次：培養(yǎng)物的觀察和檢測方法-資料下載頁
2025-02-15 05:42本頁面
【正文】 （ 2）貼壁細胞的處理 2) 玻璃培養(yǎng)瓶和蓋玻片： 終止培養(yǎng)后，首先用冷 PBS (4℃ ，無Ca2+、 Mg2+）沖洗細胞 2次后，加入冷的 含 2 mmol/L EDTA的 PBS,置于冰盒中， 10 min后換新的 EDTA消化液 。然后，用吸管吹打約 10 min，使細胞脫壁成為細胞懸液。于 4℃ 離心后固定。 此法能獲得成片細胞，細胞形狀保存完好，但超微結構受到一定影響。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 超薄切片技術 對培養(yǎng)物的預處理 （ 2）貼壁細胞的處理 3) 聚苯乙烯薄膜： 厚度與蓋玻片相仿，無毒、柔軟，是蓋玻片的良好替代物。可與細胞一起包埋切片。 處理時，在 戊二醛 固定后，將其剪成 1mm寬、 2～ 3mm長的適合包埋的小塊。 這是理想的培養(yǎng)細胞的原位包埋法。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 超薄切片技術 對培養(yǎng)物的預處理 （ 2）貼壁細胞的處理 4) 微孔濾膜： 有多種材料制成的微孔濾膜（ millipore filter membrane），如纖維素、膠原、聚苯乙烯等，均可進行原位包埋。 由于生長在濾膜的細胞可從上下兩個途徑獲取營養(yǎng)，其生長狀態(tài)可能有別于一般貼壁細胞。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標本制備 大部分程序在帶蓋的青霉素小瓶中進行。各種液體均須用雙蒸水配制。所有玻璃器皿的內壁均應用雙蒸水沖洗內壁后高溫干燥。 常規(guī)使用 戊二醛 鋨酸雙重固定法 。戊二醛 (glutaraldehyde）主要用于固定蛋白質。而鋨酸 (osmic acid)還能夠良好地保存脂類，特別是形成膜結構的脂類，并有電子染色的作用。 （ 1）固定 : 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標本制備 （ 1）固定 : 商品戊二醛 是其 25%或 50%水溶液。開瓶后如不一次用完，可在貯存瓶中加少量活性炭，去除氧化物。對已貯存長久的戊二醛亦可如此處理。 常用的 %戊二醛 （ PB）固定液，配制方法如下： （ 1） (） A液：取 NaH2PO42H 2O g,加水至 50 ml。 B液：取 Na2HPO412H 2 O ,加水至 l00ml。 取 A液 19 ml與 B液 81 ml混合，調節(jié) pH值至 。 （ 2） ％戊二醛 PB固定液：取 mol/L PB 50m1與 25%戊二醛 10 ml混合，再加水至 100 ml。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標本制備 （ 1）固定 : 鋨酸 為淡黃色結晶， 。 鋨酸溶解緩慢，至少應在使用前 24 h配液。 配液前要用酸性洗液浸泡安培數(shù)小時，再經自來水與蒸餾水先后洗滌，然后用磨砂輪劃痕（切勿手觸安培，可用紙巾包裹其一端操作），放入棕色的密封性好的瓶內。用玻棒將安培擊破后，迅速加人雙蒸水。 室溫下約一天方可溶解。鋨酸用于后固定。細胞經戊二醛前固定后，對后固定液的酸堿度等已不敏感。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標本制備 （ 1）固定 : 兩種固定劑均具有很強的揮發(fā)性。 鋨酸對人黏膜損傷尤大，故均應在通風櫥內操作，于 4℃ 保存。配好的鋨酸固定液如暫不用，可于一 20℃ 凍結以盡量減少揮發(fā)。 戊二醛固定在室溫條件下進行，一般 30 min即可。 餓酸固定在 4℃ 下進行， 1h，不必中途換液。如細胞團塊較大，可酌情延長固定時間。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標本制備 （ 1）固定 : （ 2）脫水與置換 ： （略） （ 3）環(huán)氧樹脂包埋法： （略） （ 4）具體操作程序 ： （略） （ 5）超薄切片染色 ： （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 電鏡免疫細胞化學技術 又稱 免疫電鏡技術 (immunoelectronic microscopy)。 旨在對細胞表面及內部的蛋白質、肽等具有抗原性的物質進行超微定位，亦可進行半定量的研究。 其難于光鏡免疫細胞化學之處在于，進行免疫染色前的處理既要保存抗原活性，又要保存超微結構，而后者極易受到損傷。 顯示細胞表面抗原 （略） 顯示細胞內抗原 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 其它電鏡技術 掃描電鏡技術： 掃描電鏡技術（ scanning electron microscopy）可用來觀察培養(yǎng)細胞的 外部三維形狀 及其 表面的微細結構 ，故無需切片而是力圖保持細胞的完整性。 要進行掃描電鏡觀察的細胞最好培養(yǎng)在易于移動的支持物（如蓋玻片、聚苯乙烯薄膜）上。 終止培養(yǎng)后須充分清洗。用 %戊二醛固定 1h。乙醇或丙酮脫水后（程序可與超薄切片制備相同），送臨界點干燥器干燥。然后用導電膠將支持物黏在掃描電鏡專配的標本臺（注意有細胞面朝上）。再放入真空噴鍍儀先后噴鍍碳膜與金或鉑膜，標本制備即告完成。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 其它電鏡技術 冷凍蝕刻復型技術： 冷凍蝕刻復型技術（ freeze etch replica）雖可用于顯示細胞超微結構的立體影像，但 最主要的價值在于顯示細胞膜內部的結構 ，如構成縫隙連接和緊密連接的蛋白顆粒的分布狀態(tài)、核孔等。 我的細胞培養(yǎng)計劃 （手寫和打印均可） 應包括如下內容： 培養(yǎng)目的： 實驗室條件： 已具備的條件；尚未具備的條件。 培養(yǎng)方法： 1）培養(yǎng)基的選用（含應補充的附加成分）及培養(yǎng)所需的其它用液； 2）具體操作方法及步驟（按實際操作分步列出）； 3）培養(yǎng)過程的觀察的注意事項； 目的細胞的鑒定方法： 1）具體方法（可列 1～ 3種）； 2）應出現(xiàn)的結果：陽性；陰性。 困難及解決辦法： 本課程的作業(yè)及考核依據(jù)之一 我的細胞培養(yǎng)計劃 （手寫和打印均可） 注意事項： 作業(yè)上交時間及地點： 時間：校歷第 16周（ ）前 地點： 104館三樓（組胚教研室） 作業(yè)必須標明的項目： 題 目 學號 姓名 專業(yè) 導師 本課程的作業(yè)及考核依據(jù)之一 OVE
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