[醫(yī)藥]第5次：培養(yǎng)物的觀察和檢測(cè)方法(存儲(chǔ)版)
【正文】 據(jù)認(rèn)為，免疫金銀技術(shù)敏感度高于 PAP法。常用方法為以去垢劑 Triton X脫去細(xì)胞膜中最主要的成分脂質(zhì)。 一般認(rèn)為， RNARNA雜交體的穩(wěn)定性強(qiáng)于 RNADNA雜交體，后者又強(qiáng)于 DNADNA雜交體。 對(duì)照組應(yīng)使用與實(shí)驗(yàn)組同一批傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。因此，用電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，用電鏡免疫組織化學(xué)觀察蛋白質(zhì)的超微定位變化、以及應(yīng)用其它電鏡技術(shù)，都可為細(xì)胞的研究提供有價(jià)值的信息。 細(xì)胞在瓶?jī)?nèi)原位接受 戊二醛 固定，沖洗后用電烙鐵將培養(yǎng)瓶水平割開，然后用頭端寬扁銳利的 淀帚鏟 (policeman)將細(xì)胞刮下?？膳c細(xì)胞一起包埋切片。 常規(guī)使用 戊二醛 鋨酸雙重固定法 。 B液：取 Na2HPO4 室溫下約一天方可溶解。如細(xì)胞團(tuán)塊較大，可酌情延長(zhǎng)固定時(shí)間。乙醇或丙酮脫水后（程序可與超薄切片制備相同），送臨界點(diǎn)干燥器干燥。 困難及解決辦法： 本課程的作業(yè)及考核依據(jù)之一 我的細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)劃 （手寫和打印均可） 注意事項(xiàng)： 作業(yè)上交時(shí)間及地點(diǎn)： 時(shí)間：校歷第 16周（ ）前 地點(diǎn)： 104館三樓（組胚教研室） 作業(yè)必須標(biāo)明的項(xiàng)目： 題 目 學(xué)號(hào) 姓名 專業(yè) 導(dǎo)師 本課程的作業(yè)及考核依據(jù)之一 OVER 。 終止培養(yǎng)后須充分清洗。 戊二醛固定在室溫條件下進(jìn)行，一般 30 min即可。 配液前要用酸性洗液浸泡安培數(shù)小時(shí)，再經(jīng)自來(lái)水與蒸餾水先后洗滌，然后用磨砂輪劃痕（切勿手觸安培，可用紙巾包裹其一端操作），放入棕色的密封性好的瓶?jī)?nèi)。 常用的 %戊二醛 （ PB）固定液，配制方法如下： （ 1） (） A液：取 NaH2PO4各種液體均須用雙蒸水配制。 此法能獲得成片細(xì)胞，細(xì)胞形狀保存完好，但超微結(jié)構(gòu)受到一定影響。 細(xì)胞若是生長(zhǎng)在軟質(zhì)薄膜上，可原位固定并原位包埋。結(jié)果應(yīng)為陰性。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 原位雜交技術(shù)主要實(shí)驗(yàn)材料 （ 1） 標(biāo)本的制備 （略） （ 2） 實(shí)驗(yàn)所用器具 （略） （ 3） 溶液配制 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 雜交 （ 1）雜交前處理 （略） （ 2）雜交過(guò)程 （略） （ 3）雜交后清洗 （略） （ 4）使用 RNA探針雜交的一般程序 （略） （ 5）使用 DNA探針進(jìn)行雜交的特點(diǎn) （略） （ 6）使用 DNA探針雜交的一般程序 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 顯示標(biāo)記物 半抗原標(biāo)記物的顯示：可按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。 探針與標(biāo)記物的選擇 原位雜交技術(shù)主要實(shí)驗(yàn)材料 雜交 顯示標(biāo)記物 設(shè)立對(duì)照 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 探針與標(biāo)記物的選擇 常用的探針 常用的探針有三種： cRNA探針： DNA探針： 寡核苷酸探針： 前兩者的理想長(zhǎng)度是 100個(gè)左右的堿基或堿基對(duì)。而 ICC技術(shù)的染色對(duì)象一般為完整的細(xì)胞。這樣抗原的存在部位便顯著放大。封固后的標(biāo)本不觀察時(shí)均應(yīng)置于避光、 4℃ 或低溫處。 HRP經(jīng)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)后于標(biāo)記部位形成穩(wěn)定的有色終產(chǎn)物。這兩種物質(zhì)有極強(qiáng)的親和力，并且 1分子鏈親和素可結(jié)合多分子生物素。 HRP作為一種蛋白質(zhì)可制備出相應(yīng)抗體。這種方法雖然步驟不多，然而標(biāo)記抗體操作復(fù)雜，質(zhì)量也不易保持穩(wěn)定。此法極簡(jiǎn)便快捷，并可染活細(xì)胞與固定細(xì)胞。固定后可將蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞增殖活性測(cè)定的 3HTdR摻入法 細(xì)胞增殖前必須復(fù)制 DNA，而胸腺嘧啶是 DNA的特異堿基。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 1． 溴比乙錠和碘化丙錠排除檢測(cè)法： 溴比乙錠（ ethidium bromide, EB)和碘化丙錠（ propidium iodine, PI）均為熒光染料，可與 DNA特異性結(jié)合。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞呈色。以 1 ‰ ～ ‰ 的濃度較為合適。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即 活體染料 ）對(duì)活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動(dòng)的方法。 計(jì)算公式：細(xì)胞密度＝ (4大格細(xì)胞總數(shù)／ 4) * 10,000(個(gè)／ ml) 大格 對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)算在上線和左線者 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（ cell growth curve）是觀測(cè)細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)，它以培養(yǎng)時(shí)間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。 相差顯微鏡專門用于對(duì)體外培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行觀察 。若要觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)和變化，就須借助能夠增強(qiáng)結(jié)構(gòu)之間反差的特殊顯微鏡，此即 相差顯微鏡 （ phase contrast microscope)。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。 （ 3）繪制曲線 以培養(yǎng)時(shí)間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線（見下圖所示）。而 體外活體染色 一般使用 2 ‰ 、 1 ‰ 甚至 ‰, ‰ 或者更淡的染液。 5) 加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。計(jì)算活細(xì)胞的百分比。 2 h內(nèi)熒光 保持穩(wěn)定。固定前先用 Hanks液、 PBS, BSS或生理鹽水清洗培養(yǎng)物 2次，去除妨礙染色的血清。 琥珀酸脫氫酶 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 吖啶橙（ acridine o
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