[醫(yī)藥]第5次：培養(yǎng)物的觀察和檢測(cè)方法-wenkub
2023-03-02 05:42:21 本頁面
【正文】 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 幾種最常用的方法： 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 酸性磷酸酶 酸性磷酸酶（ acid phosphatase）是溶酶體的特征性酶，故常用此法作為研究溶酶體的指標(biāo)。固定前先用 Hanks液、 PBS, BSS或生理鹽水清洗培養(yǎng)物 2次，去除妨礙染色的血清。 細(xì)胞活力測(cè)定的 MTT比色法 此法的原理是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料 MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽） 轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙?甲鐟 (formazan )顆粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用 OD值表示）反映出活細(xì)胞的代謝水平。 2 h內(nèi)熒光 保持穩(wěn)定。 （ 2）熒光染色與計(jì)數(shù)： 取細(xì)胞懸液和 EB或 PI染液各 ml，混勻。計(jì)算活細(xì)胞的百分比。 1． 臺(tái)盼藍(lán)排除檢測(cè)法： （ 1） 2％臺(tái)盼藍(lán)溶液的配制：稱取 2g臺(tái)盼藍(lán) (trypan blue），加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至 50ml，離心后取上清液，再加入 ％NaCI溶液至 100ml，即成工作液。 5) 加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 2) 加入活體染料溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置染色 1～ 2h。而 體外活體染色 一般使用 2 ‰ 、 1 ‰ 甚至 ‰, ‰ 或者更淡的染液。 真正的活體染料，既能固著在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上，又對(duì)細(xì)胞本身不產(chǎn)生明顯的毒性作用。 （ 3）繪制曲線 以培養(yǎng)時(shí)間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線（見下圖所示）。接種時(shí)間記為 0 h。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。 相差顯微鏡則是利用細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)密度的不同而對(duì)光產(chǎn)生折射率有差異的原理，在折射率大的物體中比折射率小的物體中光波前進(jìn)的距離較短，此距離差異叫光程差，由于光程差引起光的相位變化稱為相位差或相差。若要觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)和變化，就須借助能夠增強(qiáng)結(jié)構(gòu)之間反差的特殊顯微鏡，此即 相差顯微鏡 （ phase contrast microscope)。 體外培養(yǎng)的原理與技術(shù) 薛慶善 主編 廣西醫(yī)科大學(xué)組胚教研室 何少健 電話： 13367805949； 07715358577(辦 ) Email: 體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù) 一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件 二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程 三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué) 四、細(xì)胞分離與純化 五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆 六、培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 無論是在進(jìn)行體外培養(yǎng)的過程中還是在培養(yǎng)工作結(jié)束之后，經(jīng)常需要對(duì)培養(yǎng)物（培養(yǎng)的細(xì)胞或者植塊）進(jìn)行觀察檢測(cè)，以了解培養(yǎng)物的生長狀況，研究培養(yǎng)物的生命活動(dòng)變化。 相差顯微鏡專門用于對(duì)體外培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行觀察 。使用相差顯微鏡可使用肉眼不能分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿疵靼挡睿?，故使無色透明的物體在鏡下其結(jié)構(gòu)的反差顯著，影像清晰。 計(jì)算公式：細(xì)胞密度＝ (4大格細(xì)胞總數(shù)／ 4) * 10,000(個(gè)／ ml) 大格 對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)算在上線和左線者 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞生長曲線 細(xì)胞生長曲線（ cell growth curve）是觀測(cè)細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)，它以培養(yǎng)時(shí)間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。 （ 2）計(jì)數(shù)細(xì)胞密度 從接種時(shí)間算起，每隔 24h計(jì)數(shù) 3孔（瓶）內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞生長曲線 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即 活體染料 ）對(duì)活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動(dòng)的方法。 活體染料可分為 堿性活體染料 和 酸性活體染料 兩大類： 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色一般使用 堿性活體染料 （帶正電荷）。以 1 ‰ ～ ‰ 的濃度較為合適。 3) 在顯微鏡下觀察（細(xì)胞將被淡染）或作其它處理 （作選擇性標(biāo)記等）。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞呈色。 （ 2）活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù) 1) 將 1滴細(xì)胞懸液（貼壁細(xì)胞可經(jīng) %胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細(xì)胞懸液）與 2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 1． 溴比乙錠和碘化丙錠排除檢測(cè)法： 溴比乙錠（ ethidium bromide, EB)和碘化丙錠（ propidium iodine, PI）均為熒光染料，可與 DNA特異性結(jié)合。 靜置 10～ 30 min后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞增殖活性測(cè)定的 3HTdR摻入法 細(xì)胞增殖前必須復(fù)制 DNA，而胸腺嘧啶是 DNA的特異堿基。死亡細(xì)胞則無此酶活性。固定后可將蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。 其原理是該酶在酸性條件下分解 甘油磷酸鈉 ，釋放出的磷酸根與醋酸鉛的醋酸根置換，形成 磷酸鉛 ，后者與硫化胺作用，最終形成棕黑色的硫化鉛沉淀物，于鏡下清晰可辨。此法極簡(jiǎn)便快捷，并可染活細(xì)胞與固定細(xì)胞。水解過度或不足均降低染色強(qiáng)度。這種方法雖然步驟不多，然而標(biāo)記抗體操作復(fù)雜，質(zhì)量也不易保持穩(wěn)定。這樣，用二抗間接顯示抗原的方法便取代了原始的直接法。 HRP作為一種蛋白質(zhì)可制備出相應(yīng)抗體。 因此， PAP法的敏感度從理論上講比間接法（酶標(biāo)）提高了兩倍 。這兩種物質(zhì)有極強(qiáng)的親和力，并且 1分子鏈親和素可結(jié)合多分子生物素。 標(biāo)記鏈親和素 生物素 二抗 一抗 抗原 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 葡萄球菌蛋白 A法（ staphylococal
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