[醫(yī)藥]第5次：培養(yǎng)物的觀察和檢測方法-文庫吧
2025-01-31 05:42 本頁面
【正文】 盼藍(lán)排除檢測法： （ 1） 2％臺(tái)盼藍(lán)溶液的配制：稱取 2g臺(tái)盼藍(lán) (trypan blue），加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至 50ml，離心后取上清液，再加入 ％NaCI溶液至 100ml，即成工作液。 （ 2）活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù) 1) 將 1滴細(xì)胞懸液（貼壁細(xì)胞可經(jīng) %胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細(xì)胞懸液）與 2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。 2) 2 min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)至少 200個(gè)細(xì)胞。 未著色 的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色 的為死細(xì)胞。計(jì)算活細(xì)胞的百分比。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 活細(xì)胞的染料排除檢測法 1． 溴比乙錠和碘化丙錠排除檢測法： 溴比乙錠（ ethidium bromide, EB)和碘化丙錠（ propidium iodine, PI）均為熒光染料，可與 DNA特異性結(jié)合。 （ 1）染液配制： 取 EB或 PI 5mg , 枸櫞酸鈉 , NP40 ml, 共溶于 100 ml蒸餾水中。避光保存。 （ 2）熒光染色與計(jì)數(shù)： 取細(xì)胞懸液和 EB或 PI染液各 ml，混勻。 靜置 10～ 30 min后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。 發(fā)橙紅色熒光者 為死細(xì) 胞。也可用流式細(xì)胞儀測定，激發(fā)光波長為 488 nm。 2 h內(nèi)熒光 保持穩(wěn)定。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 活細(xì)胞的染料排除檢測法 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細(xì)胞增殖活性測定的 3HTdR摻入法 細(xì)胞增殖前必須復(fù)制 DNA，而胸腺嘧啶是 DNA的特異堿基。用 3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷（ TdR）摻入到新合成的 DNA中后，會(huì)均勻地分布于子細(xì)胞中。此時(shí)只要測定 3H的放射性脈沖數(shù)便可比較不同細(xì)胞的增殖活性。 細(xì)胞活力測定的 MTT比色法 此法的原理是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料 MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽） 轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙?甲鐟 (formazan )顆粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用 OD值表示）反映出活細(xì)胞的代謝水平。死亡細(xì)胞則無此酶活性。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 蘇木精 — 伊紅 （ hematoxylineosin, HE） 染色 和 Giemsa染色是觀察培養(yǎng)細(xì)胞一般形態(tài)的最常用方法，也是把細(xì)胞作為標(biāo)本保存的主要方法。 對于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，以生長于蓋玻片和塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。固定前先用 Hanks液、 PBS, BSS或生理鹽水清洗培養(yǎng)物 2次，去除妨礙染色的血清。固定后可將蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。 對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，須先經(jīng)離心沉淀 (1000 r/min, 10 min),棄上清液后（留少量液體），將細(xì)胞懸液滴于玻片上做成涂片，冷風(fēng)吹干。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ cytochemistry）可特異性地顯示細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和化學(xué)成分，其技術(shù)成熟，效果穩(wěn)定，費(fèi)用較低，即使在免疫細(xì)胞化學(xué)暢行的今天，也仍不失為有效的研究技術(shù)。 酸性磷酸酶 葡萄糖 — 6— 磷酸酶 琥珀酸脫氫酶 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 幾種最常用的方法： 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 酸性磷酸酶 酸性磷酸酶（ acid phosphatase）是溶酶體的特征性酶，故常用此法作為研究溶酶體的指標(biāo)。 其原理是該酶在酸性條件下分解 甘油磷酸鈉 ，釋放出的磷酸根與醋酸鉛的醋酸根置換，形成 磷酸鉛 ，后者與硫化胺作用，最終形成棕黑色的硫化鉛沉淀物，于鏡下清晰可辨。 葡萄糖 — 6— 磷酸酶 葡萄糖 6一磷酸酶（ glucose6phosphatase )為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志酶。 琥珀酸脫氫酶（ succinodehydrogenase）是線粒體的標(biāo)志酶，參與細(xì)胞有氧呼吸，其活性與線粒體活性平行，在癌細(xì)胞中其活性常減弱。 琥珀酸脫氫酶 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 吖啶橙（ acridine orange, AO）與細(xì)胞內(nèi)的 DNA, RNA都有親和力，但結(jié)合后卻發(fā)不同顏色的熒光， DNA呈亮綠色 ，而 RNA呈橘黃色至火紅色 。此法極簡便快捷，并可染活細(xì)胞與固定細(xì)胞。 此法原理是：在 60℃ 條件下 DNA分子中的嘌呤堿和脫氧核糖的連鍵可被 1 mol/L鹽酸水解打開，游離出的脫氧核糖醛基能與希夫（ Schiff )試劑結(jié)合，形成 紫紅色復(fù)合物 。在此過程中 RNA不受影響，故染色具 DNA特異性。 準(zhǔn)確的溫度和鹽酸濃度，適宜的水解時(shí)間是成功的關(guān)鍵。水解過度或不足均降低染色強(qiáng)度。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 免疫細(xì)胞化學(xué)（ immunocytochemistry, ICC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，以標(biāo)記抗體作為探針來顯示細(xì)胞內(nèi)抗原成分，主要是多肽與蛋白質(zhì)（包括受體、酶、分泌物前體等各種基因表達(dá)產(chǎn)物），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。在體外培養(yǎng)技術(shù)方面，ICC是鑒定細(xì)胞類型的可靠手段 。 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 常用的顯色標(biāo)記物 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 免疫細(xì)胞化學(xué)的一般問題 免疫細(xì)胞化學(xué)染色的典型程序 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 標(biāo)記物 二抗 一抗 抗原 標(biāo)記物 SPA 一抗 抗原 標(biāo)記鏈親和素 生物素 二抗 一抗 抗原 PAP復(fù)合物 二抗 一抗 抗原 間接法 SPA法 LSAB法 PAP法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理示意圖 間接法 indirect method 過氧化物酶 — 抗過氧化物酶法 peroxidaseanti peroxidase, PAP法 標(biāo)記鏈親和素 — 生物素法 labeled streptoavidin biotin, LSAB法 葡萄球菌蛋白 A法 staph
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