【正文】 是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料 MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽） 轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙?甲鐟 (formazan )顆粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用 OD值表示）反映出活細(xì)胞的代謝水平。 準(zhǔn)確的溫度和鹽酸濃度，適宜的水解時間是成功的關(guān)鍵。這樣， 1個二抗分子上間接地標(biāo)記了 3個酶分子。 異硫氰酸熒光素 （ fluorescein isothiocyanate, FITC)和 四甲基異硫氰酸羅達(dá)明 ( tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）是最常用的熒光素。 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 理想的方法應(yīng)是敏感、簡便、快速以及經(jīng)濟(jì)，但主要取決于所研究的標(biāo)本及其抗原的分布與含量。 但是， RNA易于被環(huán)境中普遍存在的 RNA酶所降解而造成假陰性結(jié)果，因此操作要求十分嚴(yán)格。 超薄切片技術(shù) 電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 其它電鏡技術(shù)簡介 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 超薄切片技術(shù) 制備超薄切片，以透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，是最主要、最基本的電鏡技術(shù)。 處理時，在 戊二醛 固定后，將其剪成 1mm寬、 2～ 3mm長的適合包埋的小塊。12H 2 O ,加水至 l00ml。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 標(biāo)本制備 （ 1）固定 : （ 2）脫水與置換 ： （略） （ 3）環(huán)氧樹脂包埋法： （略） （ 4）具體操作程序 ： （略） （ 5）超薄切片染色 ： （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 又稱 免疫電鏡技術(shù) (immunoelectronic microscopy)。 培養(yǎng)方法： 1）培養(yǎng)基的選用（含應(yīng)補(bǔ)充的附加成分）及培養(yǎng)所需的其它用液； 2）具體操作方法及步驟（按實(shí)際操作分步列出）； 3）培養(yǎng)過程的觀察的注意事項(xiàng)； 目的細(xì)胞的鑒定方法： 1）具體方法（可列 1～ 3種）； 2）應(yīng)出現(xiàn)的結(jié)果：陽性；陰性。配好的鋨酸固定液如暫不用，可于一 20℃ 凍結(jié)以盡量減少揮發(fā)。對已貯存長久的戊二醛亦可如此處理。于 4℃ 離心后固定。結(jié)果應(yīng)為陽性； ⑤ 使用半抗原標(biāo)記的探針時，應(yīng)設(shè)不加探針進(jìn)行雜交的對照，以證實(shí)半抗原的非內(nèi)源性。 ISH的原理是： 應(yīng)用帶有標(biāo)記物的已知堿基順序的 核酸探針 與細(xì)胞內(nèi)待測的核酸（ DNA或 RNA）按堿基配對的原則進(jìn)行特異性原位結(jié)合，此即為雜交 ，然后通過對標(biāo)記物的檢測而獲知待測核酸的有無及相對量。 其原理是： 使已在抗原位置沉積的金顆粒發(fā)揮催化作用，促進(jìn)銀離子被氫醌（ hydroquinone）還原為銀原子，后者圍繞金顆粒形成一層銀殼；銀殼本身也具有催化作用，使更多的銀離子還原沉積，銀殼便增大，鏡下呈黑色顆粒。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用的顯色標(biāo)記物 辣根過氧化物酶 堿性磷酸酶 用 辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase, HRP）及其它酶（如堿性磷酸酶）作標(biāo)記物的 ICC常稱為 免疫酶方法 。 該酶經(jīng)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)而呈色。 琥珀酸脫氫酶 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 吖啶橙（ acridine orange, AO）與細(xì)胞內(nèi)的 DNA, RNA都有親和力，但結(jié)合后卻發(fā)不同顏色的熒光， DNA呈亮綠色 ，而 RNA呈橘黃色至火紅色 。 2 h內(nèi)熒光 保持穩(wěn)定。 5) 加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 （ 3）繪制曲線 以培養(yǎng)時間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線（見下圖所示）。若要觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)和變化，就須借助能夠增強(qiáng)結(jié)構(gòu)之間反差的特殊顯微鏡，此即 相差顯微鏡 （ phase contrast microscope)。 計算公式：細(xì)胞密度＝ (4大格細(xì)胞總數(shù)／ 4) * 10,000(個／ ml) 大格 對于壓線的細(xì)胞只計算在上線和左線者 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細(xì)胞生長曲線 細(xì)胞生長曲線（ cell growth curve）是觀測細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)，它以培養(yǎng)時間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。以 1 ‰ ～ ‰ 的濃度較為合適。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 活細(xì)胞的染料排除檢測法 1． 溴比乙錠和碘化丙錠排除檢測法： 溴比乙錠（ ethidium bromide, EB)和碘化丙錠（ propidium iodine, PI）均為熒光染料，可與 DNA特異性結(jié)合。固定后可將蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。這種方法雖然步驟不多，然而標(biāo)記抗體操作復(fù)雜，質(zhì)量也不易保持穩(wěn)定。這兩種物質(zhì)有極強(qiáng)的親和力，并且 1分子鏈親和素可結(jié)合多分子生物素。封固后的標(biāo)本不觀察時均應(yīng)置于避光、 4℃ 或低溫處。而 ICC技術(shù)的染色對象一般為完整的細(xì)胞。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 原位雜交技術(shù)主要實(shí)驗(yàn)材料 （ 1） 標(biāo)本的制備 （略） （ 2） 實(shí)驗(yàn)所用器具 （略） （ 3） 溶液配制 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 雜交 （ 1）雜交前處理 （略） （ 2）雜交過程 （略） （ 3）雜交后清洗 （略） （ 4）使用 RNA探針雜交的一般程序 （略） （ 5）使用 DNA探針進(jìn)行雜交的特點(diǎn) （略） （ 6）使用 DNA探針雜交的一般程序 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 顯示標(biāo)記物 半抗原標(biāo)記物的顯示：可按試劑盒說明進(jìn)行。 細(xì)胞若是生長在軟質(zhì)薄膜上，可原位固定并原位包埋。各種液體均須用雙蒸水配制。 配液前要用酸性洗液浸泡安培數(shù)小時，再經(jīng)自來水與蒸餾水先后洗滌，然后用磨砂輪劃痕（切勿手觸安培，可用紙巾包裹其一端操作），放入棕色的密封性好的瓶內(nèi)。 終止培養(yǎng)后須充分清洗。乙醇或丙酮脫水后（程序可與超薄切片制備相同），