[醫(yī)藥]第5次：培養(yǎng)物的觀察和檢測方法-在線瀏覽
2025-04-04 05:42本頁面
【正文】 伊紅 （ hematoxylineosin, HE） 染色 和 Giemsa染色是觀察培養(yǎng)細(xì)胞一般形態(tài)的最常用方法，也是把細(xì)胞作為標(biāo)本保存的主要方法。固定前先用 Hanks液、 PBS, BSS或生理鹽水清洗培養(yǎng)物 2次，去除妨礙染色的血清。 對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，須先經(jīng)離心沉淀 (1000 r/min, 10 min),棄上清液后（留少量液體），將細(xì)胞懸液滴于玻片上做成涂片，冷風(fēng)吹干。 酸性磷酸酶 葡萄糖 — 6— 磷酸酶 琥珀酸脫氫酶 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 幾種最常用的方法： 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 酸性磷酸酶 酸性磷酸酶（ acid phosphatase）是溶酶體的特征性酶，故常用此法作為研究溶酶體的指標(biāo)。 葡萄糖 — 6— 磷酸酶 葡萄糖 6一磷酸酶（ glucose6phosphatase )為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志酶。 琥珀酸脫氫酶 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 DNA與 RNA的吖啶橙熒光染色法 DNA的富爾根（ Feulgen )染色法 吖啶橙（ acridine orange, AO）與細(xì)胞內(nèi)的 DNA, RNA都有親和力，但結(jié)合后卻發(fā)不同顏色的熒光， DNA呈亮綠色 ，而 RNA呈橘黃色至火紅色 。 此法原理是：在 60℃ 條件下 DNA分子中的嘌呤堿和脫氧核糖的連鍵可被 1 mol/L鹽酸水解打開，游離出的脫氧核糖醛基能與希夫（ Schiff )試劑結(jié)合，形成 紫紅色復(fù)合物 。 準(zhǔn)確的溫度和鹽酸濃度，適宜的水解時間是成功的關(guān)鍵。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 免疫細(xì)胞化學(xué)（ immunocytochemistry, ICC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，以標(biāo)記抗體作為探針來顯示細(xì)胞內(nèi)抗原成分，主要是多肽與蛋白質(zhì)（包括受體、酶、分泌物前體等各種基因表達(dá)產(chǎn)物），對其進行定位、定性及定量的研究。 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 常用的顯色標(biāo)記物 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 免疫細(xì)胞化學(xué)的一般問題 免疫細(xì)胞化學(xué)染色的典型程序 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 標(biāo)記物 二抗 一抗 抗原 標(biāo)記物 SPA 一抗 抗原 標(biāo)記鏈親和素 生物素 二抗 一抗 抗原 PAP復(fù)合物 二抗 一抗 抗原 間接法 SPA法 LSAB法 PAP法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理示意圖 間接法 indirect method 過氧化物酶 — 抗過氧化物酶法 peroxidaseanti peroxidase, PAP法 標(biāo)記鏈親和素 — 生物素法 labeled streptoavidin biotin, LSAB法 葡萄球菌蛋白 A法 staphylococal protein A, SPA法 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 間接法 最原始的 ICC技術(shù)是在獲得針對某抗原的特異性抗體后，各實驗室自行對該抗體進行標(biāo)記，然后用標(biāo)記抗體直接進行免疫染色。 由于種間的免疫球蛋白互具抗原性，這樣可以制備如抗小鼠 IgU的兔抗體，前者簡稱 一抗 ，后者簡稱 二抗 。 目前，標(biāo)記的二抗已完全商品化。 間接法（ indirect method）的另一優(yōu)點是 1個一抗分子上可以結(jié)合 35個二抗分子，因此該方法的敏感度提高。 該酶經(jīng)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)而呈色。PAP復(fù)合物即為 3個酶分子與 2個抗酶抗體結(jié)合形成的穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu) 。這樣， 1個二抗分子上間接地標(biāo)記了 3個酶分子。但由于 PAP復(fù)合物分子大，穿透性差，其敏感度增強的實際效果可能要打折扣。生物素即維生素 H。 此法即利用生物素標(biāo)記二抗，然后再加有不同標(biāo)記物的鏈親和素。 由于 1個抗體分子上可結(jié)合多至 150個生物素分子，于是，這類方法的敏感度便大大增強，一抗的稀釋度得以提高。因此，利用 HRP、熒光素或膠體金標(biāo)記的 SPA可以完成標(biāo)記二抗的功能，堪稱“廣譜二抗”。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用的顯色標(biāo)記物 辣根過氧化物酶 堿性磷酸酶 用 辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase, HRP）及其它酶（如堿性磷酸酶）作標(biāo)記物的 ICC常稱為 免疫酶方法 。 用 堿性磷酸酶 （ alkaline phosphatase, ALP）代替 HRP作標(biāo)記物進行免疫酶染色，主要用于內(nèi)源性過氧化物酶含量高的細(xì)胞，以避免非特異性染色。 異硫氰酸熒光素 （ fluorescein isothiocyanate, FITC)和 四甲基異硫氰酸羅達(dá)明 ( tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）是最常用的熒光素。但由于熒光會逐漸減退，故染色后應(yīng)盡早觀察和攝影。如封固后蓋玻片四周用指甲油（非丙酮溶劑）密封，效果則更好。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 常用的顯色標(biāo)記物 膠體金與免疫金銀技術(shù) 膠體金 (colloid gold)即金的水溶液，為最常用的金屬標(biāo)記物。 免疫金技術(shù)和免疫熒光技術(shù)一樣，免疫染色后即可于鏡下觀察，無需標(biāo)記物的顯示程序。體積大的金顆粒與抗體的結(jié)合不十分穩(wěn)定，這便降低了免疫金方法的敏感度。 其原理是： 使已在抗原位置沉積的金顆粒發(fā)揮催化作用，促進銀離子被氫醌（ hydroquinone）還原為銀原子，后者圍繞金顆粒形成一層銀殼；銀殼本身也具有催化作用，使更多的銀離子還原沉積，銀殼便增大，鏡下呈黑色顆粒。因而免疫金銀技術(shù)可以使用與抗體結(jié)合牢固的 5～ 10 nm膠體金。 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 理想的方法應(yīng)是敏感、簡便、快速以及經(jīng)濟，但主要取決于所研究的標(biāo)本及其抗原的分布與含量。如果有 熒光顯微鏡 則可采用便捷的 免疫熒光技術(shù) 。 免疫細(xì)胞化學(xué)方法及標(biāo)記物的選擇 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 ICC與 免疫組織化學(xué) （ im
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