【正文】 酶（ acid phosphatase）是溶酶體的特征性酶，故常用此法作為研究溶酶體的指標(biāo)。 細(xì)胞活力測(cè)定的 MTT比色法 此法的原理是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料 MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽） 轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙?甲鐟 (formazan )顆粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用 OD值表示）反映出活細(xì)胞的代謝水平。 （ 2）熒光染色與計(jì)數(shù)： 取細(xì)胞懸液和 EB或 PI染液各 ml，混勻。 1． 臺(tái)盼藍(lán)排除檢測(cè)法： （ 1） 2％臺(tái)盼藍(lán)溶液的配制：稱取 2g臺(tái)盼藍(lán) (trypan blue），加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至 50ml，離心后取上清液，再加入 ％NaCI溶液至 100ml，即成工作液。 2) 加入活體染料溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置染色 1～ 2h。 真正的活體染料，既能固著在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上，又對(duì)細(xì)胞本身不產(chǎn)生明顯的毒性作用。接種時(shí)間記為 0 h。 相差顯微鏡則是利用細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)密度的不同而對(duì)光產(chǎn)生折射率有差異的原理，在折射率大的物體中比折射率小的物體中光波前進(jìn)的距離較短，此距離差異叫光程差，由于光程差引起光的相位變化稱為相位差或相差。 體外培養(yǎng)的原理與技術(shù) 薛慶善 主編 廣西醫(yī)科大學(xué)組胚教研室 何少健 電話： 13367805949； 07715358577(辦 ) Email: 體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù) 一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長(zhǎng)條件 二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程 三、體外培養(yǎng)物的生長(zhǎng)生物學(xué) 四、細(xì)胞分離與純化 五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆 六、培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 無論是在進(jìn)行體外培養(yǎng)的過程中還是在培養(yǎng)工作結(jié)束之后，經(jīng)常需要對(duì)培養(yǎng)物（培養(yǎng)的細(xì)胞或者植塊）進(jìn)行觀察檢測(cè)，以了解培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀況，研究培養(yǎng)物的生命活動(dòng)變化。使用相差顯微鏡可使用肉眼不能分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿疵靼挡睿?，故使無色透明的物體在鏡下其結(jié)構(gòu)的反差顯著，影像清晰。 （ 2）計(jì)數(shù)細(xì)胞密度 從接種時(shí)間算起，每隔 24h計(jì)數(shù) 3孔（瓶）內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。 活體染料可分為 堿性活體染料 和 酸性活體染料 兩大類： 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色一般使用 堿性活體染料 （帶正電荷）。 3) 在顯微鏡下觀察（細(xì)胞將被淡染）或作其它處理 （作選擇性標(biāo)記等）。 （ 2）活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù) 1) 將 1滴細(xì)胞懸液（貼壁細(xì)胞可經(jīng) %胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細(xì)胞懸液）與 2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。 靜置 10～ 30 min后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。死亡細(xì)胞則無此酶活性。 其原理是該酶在酸性條件下分解 甘油磷酸鈉 ，釋放出的磷酸根與醋酸鉛的醋酸根置換，形成 磷酸鉛 ，后者與硫化胺作用，最終形成棕黑色的硫化鉛沉淀物，于鏡下清晰可辨。水解過度或不足均降低染色強(qiáng)度。這樣，用二抗間接顯示抗原的方法便取代了原始的直接法。 因此， PAP法的敏感度從理論上講比間接法（酶標(biāo)）提高了兩倍 。 標(biāo)記鏈親和素 生物素 二抗 一抗 抗原 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 葡萄球菌蛋白 A法（ staphylococal protein A, SPA法） SPA具有與人、小鼠、豬以及猴等動(dòng)物的抗體 Fc段結(jié)合的能力。 用熒光素作標(biāo)記物無需呈色反應(yīng)，因而省時(shí)簡(jiǎn)便。 供光鏡觀察的免疫金染色使用的膠體金顆粒直徑通常較大，為 20nm，鏡下呈粉紅色。 一般來講，估計(jì)抗原含量中等以上的標(biāo)本可應(yīng)用 間接法 或SPA法 。 用小分子量的熒光素或生物素標(biāo)記的二抗均比酶標(biāo)者穿透性大，用SPA代替二抗也是一種明智的選擇。 單鏈 DNA探針由于 PCR技術(shù)的推廣，其合成與操作均比 RNA探針簡(jiǎn)易，應(yīng)用日漸增多。結(jié)果應(yīng)為陰性； ② 使用 cRNA探針時(shí)，應(yīng)用與靶 mRNA堿基序列相同的同義 RNA探針作對(duì)照。 對(duì)培養(yǎng)物的預(yù)處理 （ 1）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的處理 （ 2） 貼壁細(xì)胞的處理 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 超薄切片技術(shù) 對(duì)培養(yǎng)物的預(yù)處理 （ 1）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的處理 終止培養(yǎng)后，首先將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管離心 5min，使之形成既不松散又不過于緊密的細(xì)胞團(tuán)塊，然后像組織塊那樣處理。絕大部分細(xì)胞的基底面結(jié)構(gòu)保存完好。 這是理想的培養(yǎng)細(xì)胞的原位包埋法。而鋨酸 (osmic acid)還能夠良好地保存脂類，特別是形成膜結(jié)構(gòu)的脂類，并有電子染色的作用。 取 A液 19 ml與 B液 81 ml混合，調(diào)節(jié) pH值至 。細(xì)胞經(jīng)戊二醛前固定后，對(duì)后固定液的酸堿度等已不敏感。 旨在對(duì)細(xì)胞表面及內(nèi)部的蛋白質(zhì)、肽等具有抗原性的物質(zhì)進(jìn)行超微定位，亦可進(jìn)行半定量的研究。再放入真空噴鍍儀先后噴鍍碳膜與金或鉑膜，標(biāo)本制備即告完成。 我的細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)劃 （手寫和打印均可） 應(yīng)包括如下內(nèi)容： 培養(yǎng)目的： 實(shí)驗(yàn)室條件： 已具備的條件；尚未具備的條件。 顯示細(xì)胞表面抗原 （略） 顯示細(xì)胞內(nèi)抗原 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 其它電鏡技術(shù) 掃描電鏡技術(shù)： 掃描電鏡技術(shù)（ scanning electron microscopy）可用來觀察培養(yǎng)細(xì)胞的 外部三維形狀 及其 表面的微細(xì)結(jié)構(gòu) ，故無需切片而是力圖保持細(xì)胞的完整性。 鋨酸對(duì)人黏膜損傷尤大，故均應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，于 4℃ 保存。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 標(biāo)本制備 （ 1）固定 : 鋨酸 為淡黃色結(jié)晶， 。開瓶后如不一次用完，可在貯存瓶中加少量活性炭，去除氧化物。 由于生長(zhǎng)在濾膜的細(xì)胞可從上下兩個(gè)途徑獲取營養(yǎng)，其生長(zhǎng)狀態(tài)可能有別于一般貼壁細(xì)胞。然后，用吸管吹打約 10 min，使細(xì)胞脫壁成為細(xì)胞懸液。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 超薄切片技術(shù) 對(duì)培養(yǎng)物的預(yù)處理 對(duì)于在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，可先行原位固定后再收獲細(xì)胞進(jìn)行包埋。結(jié)果應(yīng)為陽性； ④ 用 Southern或 Northern印跡雜交法證明標(biāo)本中含有原位雜交所要檢測(cè)的 DNA或 RNA