【正文】 觀察檢測方法 細(xì)胞生長曲線 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即 活體染料 ）對活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動的方法。如此操作至第七天結(jié)束。 （ 2）計(jì)數(shù)細(xì)胞密度 從接種時間算起，每隔 24h計(jì)數(shù) 3孔（瓶）內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。計(jì)數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度。 計(jì)算公式：細(xì)胞密度＝ (4大格細(xì)胞總數(shù)／ 4) * 10,000(個／ ml) 大格 對于壓線的細(xì)胞只計(jì)算在上線和左線者 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細(xì)胞生長曲線 細(xì)胞生長曲線（ cell growth curve）是觀測細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)，它以培養(yǎng)時間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。一般利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板（即血細(xì)胞計(jì)數(shù)板）進(jìn)行（見右圖）。使用相差顯微鏡可使用肉眼不能分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿疵靼挡睿?，故使無色透明的物體在鏡下其結(jié)構(gòu)的反差顯著，影像清晰。 相差顯微鏡的原理： 用一般光鏡之所以難以看清活細(xì)胞，是由于活細(xì)胞無色透明，當(dāng)光波通過它時，顏色和亮度變化不大。 相差顯微鏡專門用于對體外培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行觀察 。 觀察檢測體外培養(yǎng)物最常用的技術(shù)方法，包括： 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu) 由于培養(yǎng)的細(xì)胞在生活狀態(tài)下，幾乎是透明的，結(jié)構(gòu)之間的反差很小，如果用普通光學(xué)顯微鏡觀察，看不清活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 體外培養(yǎng)的原理與技術(shù) 薛慶善 主編 廣西醫(yī)科大學(xué)組胚教研室 何少健 電話： 13367805949； 07715358577(辦 ) Email: 體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù) 一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件 二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程 三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué) 四、細(xì)胞分離與純化 五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆 六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法 無論是在進(jìn)行體外培養(yǎng)的過程中還是在培養(yǎng)工作結(jié)束之后，經(jīng)常需要對培養(yǎng)物（培養(yǎng)的細(xì)胞或者植塊）進(jìn)行觀察檢測，以了解培養(yǎng)物的生長狀況，研究培養(yǎng)物的生命活動變化。 這方面的內(nèi)容涉及到形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生理生化、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)手段。若要觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)和變化，就須借助能夠增強(qiáng)結(jié)構(gòu)之間反差的特殊顯微鏡，此即 相差顯微鏡 （ phase contrast microscope)。用相差顯微鏡可直接觀察到活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分裂增殖的動態(tài)變化及細(xì)胞運(yùn)動等各種生命現(xiàn)象。 相差顯微鏡則是利用細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)密度的不同而對光產(chǎn)生折射率有差異的原理，在折射率大的物體中比折射率小的物體中光波前進(jìn)的距離較短，此距離差異叫光程差，由于光程差引起光的相位變化稱為相位差或相差。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 相差顯微鏡 相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu) Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600x – Bright Field Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600x Phase Contrast 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 用相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的方法 （略） 相差顯微鏡 相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu) 活細(xì)胞的動態(tài)觀察與縮時電影 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細(xì)胞計(jì)數(shù)法 細(xì)胞計(jì)數(shù)法（ cell counting）是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。 制作細(xì)胞生長曲線的過程： （ 1）培養(yǎng)細(xì)胞 首先在培養(yǎng)板的 21個孔內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞（如果使用培養(yǎng)瓶，則需接種 21瓶）。接種時間記為 0 h。為提高準(zhǔn)確率，對每孔（瓶）細(xì)胞可計(jì)數(shù) 2～ 3次。 （ 3）繪制曲線 以培養(yǎng)時間（ d)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線（見下圖所示）。 利用這種方法，可以對培養(yǎng)物進(jìn)行染色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。 真正的活體染料，既能固著在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上，又對細(xì)胞本身不產(chǎn)生明顯的毒性作用。 酸性活體染料 多用于體內(nèi)活體染色，體外活細(xì)胞難以著色。而 體外活體染色 一般使用 2 ‰ 、 1 ‰ 甚至 ‰, ‰ 或者更淡的染液。 可以用平衡鹽溶液、 PBS或生理鹽水等配制。 2) 加入活體染料溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置染色 1～ 2h。 4) 傾去染液。 5) 加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。而活細(xì)胞反之，能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，因而不易著色。 1． 臺盼藍(lán)排除檢測法： （ 1） 2％臺盼藍(lán)溶液的配制：稱取 2g臺盼藍(lán) (trypan blue），加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至 50ml，離心后取上清液，再加入 ％NaCI溶液至 100ml，即成工作液。 2) 2 min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)至少 200個細(xì)胞。計(jì)算活細(xì)胞的百分比。 （ 1）染液配制： 取 EB或 PI 5mg , 枸櫞酸鈉 , NP40 ml, 共溶于 100 ml蒸餾水中。 （ 2）熒光染色與計(jì)數(shù)： 取細(xì)胞懸液和 EB或 PI染液各 ml，混勻。 發(fā)橙紅色熒光者 為死細(xì) 胞。 2 h內(nèi)熒光 保持穩(wěn)定。用 3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷（ TdR）摻入到新合成的 DNA中后，會均勻地分布于子細(xì)胞中。 細(xì)胞活力測定的 MTT比色法 此法的原理是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料 MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽） 轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙?甲鐟 (formazan )顆粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用 OD值表示）反映出活細(xì)胞的代謝水平。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 蘇木精 —