[醫(yī)藥]第5次：培養(yǎng)物的觀察和檢測(cè)方法-文庫(kù)吧資料
2025-02-21 05:42本頁(yè)面
【正文】 中等以下宜采用 LSAB法 、 PAP法 或者 免疫金銀技術(shù) 。 一般來(lái)講，估計(jì)抗原含量中等以上的標(biāo)本可應(yīng)用 間接法 或SPA法 。 據(jù)認(rèn)為，免疫金銀技術(shù)敏感度高于 PAP法。這樣抗原的存在部位便顯著放大。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 常用的顯色標(biāo)記物 膠體金與免疫金銀技術(shù) 爾后發(fā)明的 免疫金銀技術(shù) 則有效地避免了這一缺陷。 供光鏡觀察的免疫金染色使用的膠體金顆粒直徑通常較大，為 20nm，鏡下呈粉紅色。用膠體金作標(biāo)記物的 ICC稱(chēng) 免疫金技術(shù) 。封固后的標(biāo)本不觀察時(shí)均應(yīng)置于避光、 4℃ 或低溫處。 近年啟用的 抗褪色劑 DABCO[14diazabicyclo(222) octane］封固能有效延長(zhǎng)染色后標(biāo)本的可觀察期至一周或更長(zhǎng)。 用熒光素作標(biāo)記物無(wú)需呈色反應(yīng)，因而省時(shí)簡(jiǎn)便。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 常用的顯色標(biāo)記物 熒光素 用 熒光素 （ (luorescein)作標(biāo)記物的 ICC常稱(chēng)為 免疫熒光技術(shù) 。 HRP經(jīng)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)后于標(biāo)記部位形成穩(wěn)定的有色終產(chǎn)物。 SPA的分子量小，穿透細(xì)胞的能力強(qiáng)于抗體，這樣可提高方法的敏感度。 標(biāo)記鏈親和素 生物素 二抗 一抗 抗原 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 葡萄球菌蛋白 A法（ staphylococal protein A, SPA法） SPA具有與人、小鼠、豬以及猴等動(dòng)物的抗體 Fc段結(jié)合的能力。對(duì)鏈親和素的標(biāo)記方法有多種，簡(jiǎn)單者如將鏈親和素標(biāo)記上 HRP或熒光素，復(fù)雜者則制備出 鏈親和素（或親合素） — 生物素 — PAP復(fù)合物（ avidinbiotin PAP plex)，后者即 ABC法。這兩種物質(zhì)有極強(qiáng)的親和力，并且 1分子鏈親和素可結(jié)合多分子生物素。 PAP 復(fù)合物 二抗 一抗 抗原 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 標(biāo)記鏈親和素 — 生物素法 （ labeled streptoavidin biotin, LSAB法） 鏈親和素 是從鏈球菌提取的一種糖蛋白。 因此， PAP法的敏感度從理論上講比間接法（酶標(biāo)）提高了兩倍 。 此法的前提是抗酶抗體與一抗同源，即可與二抗結(jié)合。 HRP作為一種蛋白質(zhì)可制備出相應(yīng)抗體。 標(biāo)記物 二抗 一抗 抗原 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 常用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理 過(guò)氧化物酶 — 抗過(guò)氧化物酶法 （ peroxidaseantiperoxidase, PAP法） 這里的 過(guò)氧化物酶 特指 辣根過(guò)氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP）。這樣，用二抗間接顯示抗原的方法便取代了原始的直接法。二抗可以與所有特異性不同的小鼠一抗結(jié)合，只需要標(biāo)記二抗便解決了標(biāo)記不同一抗的麻煩。這種方法雖然步驟不多，然而標(biāo)記抗體操作復(fù)雜，質(zhì)量也不易保持穩(wěn)定。在體外培養(yǎng)技術(shù)方面，ICC是鑒定細(xì)胞類(lèi)型的可靠手段 。水解過(guò)度或不足均降低染色強(qiáng)度。在此過(guò)程中 RNA不受影響，故染色具 DNA特異性。此法極簡(jiǎn)便快捷，并可染活細(xì)胞與固定細(xì)胞。 琥珀酸脫氫酶（ succinodehydrogenase）是線粒體的標(biāo)志酶，參與細(xì)胞有氧呼吸，其活性與線粒體活性平行，在癌細(xì)胞中其活性常減弱。 其原理是該酶在酸性條件下分解 甘油磷酸鈉 ，釋放出的磷酸根與醋酸鉛的醋酸根置換，形成 磷酸鉛 ，后者與硫化胺作用，最終形成棕黑色的硫化鉛沉淀物，于鏡下清晰可辨。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ cytochemistry）可特異性地顯示細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和化學(xué)成分，其技術(shù)成熟，效果穩(wěn)定，費(fèi)用較低，即使在免疫細(xì)胞化學(xué)暢行的今天，也仍不失為有效的研究技術(shù)。固定后可將蓋玻片用樹(shù)膠貼于載玻片上，以利操作。 對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，以生長(zhǎng)于蓋玻片和塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。死亡細(xì)胞則無(wú)此酶活性。此時(shí)只要測(cè)定 3H的放射性脈沖數(shù)便可比較不同細(xì)胞的增殖活性。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 細(xì)胞增殖活性測(cè)定的 3HTdR摻入法 細(xì)胞增殖前必須復(fù)制 DNA，而胸腺嘧啶是 DNA的特異堿基。也可用流式細(xì)胞儀測(cè)定，激發(fā)光波長(zhǎng)為 488 nm。 靜置 10～ 30 min后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。避光保存。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 1． 溴比乙錠和碘化丙錠排除檢測(cè)法： 溴比乙錠（ ethidium bromide, EB)和碘化丙錠（ propidium iodine, PI）均為熒光染料，可與 DNA特異性結(jié)合。 未著色 的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色 的為死細(xì)胞。 （ 2）活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù) 1) 將 1滴細(xì)胞懸液（貼壁細(xì)胞可經(jīng) %胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細(xì)胞懸液）與 2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。 此法的原理即是利用死、活細(xì)胞對(duì)染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開(kāi)兩種細(xì)胞。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 活細(xì)胞的染料排除檢測(cè)法 由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞呈色。用平衡鹽溶液、 PBS或生理鹽水洗滌。 3) 在顯微鏡下觀察（細(xì)胞將被淡染）或作其它處理 （作選擇性標(biāo)記等）。 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 體外活體染色觀察與活體染料 染色步驟 1) 吸去培養(yǎng)液，將培養(yǎng)物用平衡鹽溶液 ,PBS或生理鹽水稍事洗滌。以 1 ‰ ～ ‰ 的濃度較為合適。 活體染料的類(lèi)別 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 體外活體染色觀察與活體染料 工作濃度 體內(nèi)活體染色 時(shí)，注射的活體染料溶液濃度可高達(dá) 1％甚至 2％ 。 活體染料可分為 堿性活體染料 和 酸性活體染料 兩大類(lèi)： 培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色一般使用 堿性活體染料 （帶正電荷）。 能夠 使活細(xì)胞著色 而不影響細(xì)胞生命的染料就是 活體染料 。 培養(yǎng)物的
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