[醫(yī)藥]第5次：培養(yǎng)物的觀察和檢測方法(已修改)
2025-02-27 05:42 本頁面
【正文】 體外培養(yǎng)的原理與技術 薛慶善 主編 廣西醫(yī)科大學組胚教研室 何少健 電話： 13367805949； 07715358577(辦 ) Email: 體外培養(yǎng)的基本原理與技術 一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件 二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程 三、體外培養(yǎng)物的生長生物學 四、細胞分離與純化 五、細胞系（株）、細胞克隆 六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法 無論是在進行體外培養(yǎng)的過程中還是在培養(yǎng)工作結束之后，經(jīng)常需要對培養(yǎng)物（培養(yǎng)的細胞或者植塊）進行觀察檢測，以了解培養(yǎng)物的生長狀況，研究培養(yǎng)物的生命活動變化。 這方面的內(nèi)容涉及到形態(tài)學、細胞生物學、生理生化、遺傳學以及分子生物學等多學科的技術手段。 觀察檢測體外培養(yǎng)物最常用的技術方法，包括： 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物的形態(tài)結構 由于培養(yǎng)的細胞在生活狀態(tài)下，幾乎是透明的，結構之間的反差很小，如果用普通光學顯微鏡觀察，看不清活細胞的形態(tài)結構。若要觀察其微細結構和變化，就須借助能夠增強結構之間反差的特殊顯微鏡，此即 相差顯微鏡 （ phase contrast microscope)。 相差顯微鏡專門用于對體外培養(yǎng)的活細胞進行觀察 。用相差顯微鏡可直接觀察到活細胞的形態(tài)結構、分裂增殖的動態(tài)變化及細胞運動等各種生命現(xiàn)象。 相差顯微鏡的原理： 用一般光鏡之所以難以看清活細胞，是由于活細胞無色透明，當光波通過它時，顏色和亮度變化不大。 相差顯微鏡則是利用細胞內(nèi)各結構密度的不同而對光產(chǎn)生折射率有差異的原理，在折射率大的物體中比折射率小的物體中光波前進的距離較短，此距離差異叫光程差，由于光程差引起光的相位變化稱為相位差或相差。使用相差顯微鏡可使用肉眼不能分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿疵靼挡睿?，故使無色透明的物體在鏡下其結構的反差顯著，影像清晰。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 相差顯微鏡 相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物的形態(tài)結構 Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600x – Bright Field Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600x Phase Contrast 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 用相差顯微鏡觀察活細胞的方法 （略） 相差顯微鏡 相差顯微鏡觀察培養(yǎng)物的形態(tài)結構 活細胞的動態(tài)觀察與縮時電影 （略） 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細胞計數(shù)法 細胞計數(shù)法（ cell counting）是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法。一般利用細胞計數(shù)板（即血細胞計數(shù)板）進行（見右圖）。既可用于分離（散）細胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，也可用于對培養(yǎng)物的細胞數(shù)量進行計數(shù)。 計算公式：細胞密度＝ (4大格細胞總數(shù)／ 4) * 10,000(個／ ml) 大格 對于壓線的細胞只計算在上線和左線者 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細胞生長曲線 細胞生長曲線（ cell growth curve）是觀測細胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標，它以培養(yǎng)時間（ d)為橫坐標、細胞密度為縱坐標作坐標圖。 制作細胞生長曲線的過程： （ 1）培養(yǎng)細胞 首先在培養(yǎng)板的 21個孔內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞（如果使用培養(yǎng)瓶，則需接種 21瓶）。計數(shù)并記錄接種的細胞懸液之密度。接種時間記為 0 h。 （ 2）計數(shù)細胞密度 從接種時間算起，每隔 24h計數(shù) 3孔（瓶）內(nèi)的細胞密度，算出平均值。為提高準確率，對每孔（瓶）細胞可計數(shù) 2～ 3次。如此操作至第七天結束。 （ 3）繪制曲線 以培養(yǎng)時間（ d)為橫坐標、細胞密度為縱坐標，將全部結果在坐標紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細胞的生長曲線（見下圖所示）。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 細胞生長曲線 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即 活體染料 ）對活的組織或細胞進行染色，而不影響活細胞的生命活動的方法。 利用這種方法，可以對培養(yǎng)物進行染色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進行培養(yǎng)。 能夠 使活細胞著色 而不影響細胞生命的染料就是 活體染料 。 真正的活體染料，既能固著在活細胞的某種結構上，又對細胞本身不產(chǎn)生明顯的毒性作用。 活體染料可分為 堿性活體染料 和 酸性活體染料 兩大類： 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 體外活體染色觀察與活體染料 體外活體染色一般使用 堿性活體染料 （帶正電荷）。 酸性活體染料 多用于體內(nèi)活體染色，體外活細胞難以著色。 活體染料的類別 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 體外活體染色觀察與活體染料 工作濃度 體內(nèi)活體染色 時，注射的活體染料溶液濃度可高達 1％甚至 2％ 。而 體外活體染色 一般使用 2 ‰ 、 1 ‰ 甚至 ‰, ‰ 或者更淡的染液。以 1 ‰ ～ ‰ 的濃度較為合適。 可以用平衡鹽溶液、 PBS或生理鹽水等配制。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 體外活體染色觀察與活體染料 染色步驟 1) 吸去培養(yǎng)液，將培養(yǎng)物用平衡鹽溶液 ,PBS或生理鹽水稍事洗滌。 2) 加入活體染料溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置染色 1～ 2h。 3) 在顯微鏡下觀察（細胞將被淡染）或作其它處理 （作選擇性標記等）。 4) 傾去染液。用平衡鹽溶液、 PBS或生理鹽水洗滌。 5) 加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 培養(yǎng)物的觀察檢測方法 活細胞的染料排除檢測法 由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入?yún)s不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內(nèi)的染料，因而不易著色。 此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應而區(qū)分開兩種細胞。 1． 臺
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