【正文】 （五）魚類免疫效果的檢測方法 1. 免疫保護(hù)效果檢測： 接種疫苗 ?(24周 )致病菌攻毒 ?(1020d)成活率 2. 免。 （三）幾種常見魚類疫苗的制備方法 1. 病毒性疫苗（組織苗）的制備方法 勻漿 , 3000rpm,30min 上清液 +(800單位青霉素 +800單位鏈霉素 )/ml 病魚組織 +生理鹽水 沉淀 加 1‰ 福爾馬林， 32℃ 72h 安全檢測 冷凍保存 組織苗 效力檢測 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 2. 細(xì)菌滅活疫苗的制備方法 擴(kuò)大培養(yǎng) 5000rpm, 30min, PBS配制 病原菌 大量病菌 1%菌懸液 活菌檢測 安全檢測 410‰ 福爾馬林 毒性檢測 4℃ , 24h 疫苗 抗體效價(jià)檢測 免疫效果檢測 ‰ 疊氮鈉 攻毒試驗(yàn) 4℃ 保存 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 3. 脂多糖 (LPS)疫苗的制備 (主要針對 G) %formalin, 上清液 加 PBS 病菌擴(kuò)大培養(yǎng) 5000rpm, 30min 沉淀 滅活菌懸液 4℃ , 透析 3d 90%苯酚 (1:1) LPS水溶液 水層 65℃ , 10min 聚乙二醇 2022 中間層 混合液 苯酚層 10000rpm, 30min 濃縮 LPS溶液 冷凍干燥 粗制 LPS LPS疫苗 PBS溶解，加熱去毒 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 （四）魚類免疫應(yīng)答的過程 1. 硬骨魚類參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞和器官 1) 參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞： 巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞 2) 參與免疫反應(yīng)的器官： 胸腺、腎 (主要為頭腎 )、脾等。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單； 缺點(diǎn)： 免疫效果差 。 優(yōu)點(diǎn)： 免疫效果好； 缺點(diǎn)： 操作困難，易損傷接種魚類，幼魚無法使用 。 6. 合成疫苗： 將具有保護(hù)性免疫力的人工合成肽與適當(dāng)載體結(jié)合后，再加入佐劑制成的疫苗稱為合成疫苗 優(yōu)點(diǎn)： 作用效果好，易于規(guī)模生產(chǎn)； 缺點(diǎn)： 研究難度大。 優(yōu)點(diǎn)： 可除去有害成分，減少異常反應(yīng)，提高免疫效果； 缺點(diǎn)： 制造過程復(fù)雜、成本高。 缺點(diǎn)： 弱毒（減毒）疫苗 — 安全性較差 異種疫苗 — 獲得比較困難 3. 化學(xué)疫苗： 以化學(xué)方法提取病菌有效成分 (如 LPS)制成 優(yōu)點(diǎn)： 免疫劑量小，免疫原性強(qiáng)，作用穩(wěn)定； 缺點(diǎn)： 制造較復(fù)雜，成本稍高。 免疫： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 （一）魚用疫苗的種類 A. 根據(jù)疫苗的獲得方法來分： 1. 死疫苗 (滅活疫苗 )： 熱滅活、化學(xué)滅活、紫外線滅活、超聲滅活等 優(yōu)點(diǎn)： 安全性好，制造簡單； 缺點(diǎn)： 免疫劑量大，免疫持久性差。 過程： 先將抗原（疫苗）注入同種或其他種動(dòng)物機(jī)體， 14周后從接種動(dòng)物的血液等部位提取抗體（或制備卵黃抗體），并將提取的抗體接種到患病動(dòng)物中進(jìn)行疾病治療。 ： 將已知抗體與從病體中分離的病原進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，以確定病原的種類，該法適于所有被診斷動(dòng)物。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)原理的應(yīng)用 第五節(jié) 免疫學(xué)原理在魚蝦病害防治中的應(yīng)用 一、用于疾病的診斷 （免疫診斷方法有二類） ： 用已知抗原與從患病動(dòng)物中提取的抗體進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，以確定病原種類。 (2) 包埋前免疫染色： 組織固定 ? 厚切片 ?免疫染色 ?包埋 ?超薄切片? 投射電鏡觀察。 2. 種類： (1) 非包埋法免疫染色： 該法是以超薄冷凍切片進(jìn)行免疫染色。 原理 ： （五）免疫電鏡技術(shù) 1. 定義： 在保持抗體免疫性的前提下，用高電子密度的標(biāo)記物（如鐵蛋白、金等），或用經(jīng)細(xì)胞化學(xué)方法處理使電子密度增高的標(biāo)記物（如辣根過氧化物酶等酶類）標(biāo)記抗體后，將標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合，然后用電子顯微鏡觀察的技術(shù)。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 該技術(shù)是將發(fā)光分析（ 化學(xué)發(fā)光 和生物發(fā)光 ）和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新型超微量分析技術(shù)。 2. 種類： 包括熒光免疫組織化學(xué) (如熒光抗體 )技術(shù)和熒光免疫測定。 (5) 試驗(yàn)時(shí)，在同樣條件下，根據(jù)待測 Ag的放射性結(jié)合率，依標(biāo)準(zhǔn)曲線查出 Ag量。計(jì)算 B/F值，繪制 B/F和 Ag量的關(guān)系曲線圖。 2. 原理與方法： 其基本原理為：待測抗原和標(biāo)記抗原對有限量抗體存在 競爭性結(jié)合 ： Ag* + Ab ? Ag*Ab； Ag + Ab ? AgAb (1) 抗原用同位素 (如 131I、 3H等 ) 標(biāo)記后仍能與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合； (2) 將兩類抗原與抗體混合后，兩類抗原均能與抗體結(jié)合，當(dāng) Ag*和 Ab數(shù)量恒定，且 Ag*與 Ag之和大于 Ab上結(jié)合點(diǎn)數(shù)目時(shí)， Ag*與 Ag 存在競爭抑制： Ag數(shù)量增加， AbAb生成量增加， Ag*Ab數(shù)量就減少，游離的 Ag*就增多。 加待測抗原 加酶標(biāo)抗體 已知抗體吸附 抗原抗體復(fù)合物 酶聯(lián)抗體抗原抗體復(fù)合物 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 （三）放射免疫測定技術(shù) (Radioimmunoassay, RIA) 1. 定義： 用放射性同位素標(biāo)記來檢測抗原抗體反應(yīng)的高靈敏度的技術(shù)。 （待測樣品中的總抗體）時(shí)： 以不同稀釋度的待測樣品 (Ab)包被酶標(biāo)板反應(yīng)板，孵育后洗滌 ?封閉酶標(biāo)板，孵育后洗滌 ?加入酶標(biāo)抗抗體，孵育后洗滌 ?加入底物，測定酶促反應(yīng)強(qiáng)度。它目前包括 直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法、抗原競爭法、抑制性測定法和橋聯(lián)法 等多種。 5. 特點(diǎn)： 敏感性高、特異性強(qiáng)，既可定性又可定量。 3. 標(biāo)記酶： 辣根過氧化物酶（ HRP）和堿性磷酸酶；它們與抗原或抗體結(jié)合后活性不受影響。 2. 顯示方法： 用酶的特殊底物來處理反應(yīng)后的標(biāo)本，通過酶催化底物的顯色反應(yīng)來測定抗原或抗體的存在 。 (4) 特點(diǎn)： 簡單、特異性高；敏感性低、同時(shí)檢測多種抗原時(shí)較復(fù)雜。 2. 熒光物種類： 異硫氰酸熒光素、羅丹明熒光素、二氯三嗪基氨基熒光素等 3. 種類： 包括直接法、間接法和補(bǔ)體法 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 例： 直接法： 將待測標(biāo)本（抗原）固定于玻片表面，滴加已知熒光抗體后再以緩沖液沖洗，干燥后于熒光顯微鏡下觀察。 免疫： 免疫學(xué)方法及其應(yīng)用 四、現(xiàn)代免疫標(biāo)記技術(shù)（ immunolabelling technique） 定義： 將抗原或抗體用熒光素、酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等加以標(biāo)記，以提高抗原抗體反應(yīng)以及抗原或抗體檢測靈敏度的一類新技術(shù)。臨床可用抗毒素治療由細(xì)菌外毒素所致的疾病。 ? : 是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)，可用來檢查患病后或人工免疫后機(jī)體血清中中和抗體的增長情況，也可用來鑒定病毒或研究病毒抗原結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是多組抗原抗體存在時(shí)沉淀線易重疊在一起，缺乏分辨力。經(jīng)過一定泳動(dòng)時(shí)間后，在比例最適處，形成肉眼可見的白色沉淀線。 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 c. 對流免疫電泳 (Counter immunoelectrophoresis, CIE)： 將抗原和抗體分別加入半固體瓊脂孔內(nèi)，在堿性緩沖液中（如 PH＝ ）進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷，在電場中由陰極向陽極移動(dòng)。該方法可用來分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分，或測定抗原、抗體提取物的純度。 結(jié)果： 陽性 — 白色沉淀環(huán)； 陰性 — 無 b. 雙向免疫擴(kuò)散 (double immunodiffusion)： 預(yù)先制備瓊脂板，根據(jù)需要在瓊脂板上打孔，再將抗原、抗體分別加入不同孔內(nèi)，使兩者相互擴(kuò)散，若抗原抗體相對應(yīng)，則二者在合適比例處形成白色沉淀線。 2. 沉淀反應(yīng)的種類與應(yīng)用： 1) 經(jīng)典方法： a. 環(huán)狀沉淀反應(yīng)： 在小試管中加入抗血清 + 緩慢加入待測抗原 ? (數(shù) 分鐘 )結(jié)果： 陽性 — 白色沉淀環(huán)； 陰性 — 無 ： 將已知抗體與待測抗原混勻于試管或凹玻片 ?結(jié)果： 陽性 — 絮狀沉淀； 陰性 — 無 免疫應(yīng)用： 免疫學(xué)方法 2) 現(xiàn)代方法： a. 單免疫擴(kuò)散 (single immunodiffusion)： 將適當(dāng)濃度的已知抗體預(yù)先混在 1~% 瓊脂內(nèi)制成凝膠板，再以適當(dāng)距離在板上打孔，孔中加入待測抗原，當(dāng)抗原向周圍擴(kuò)散時(shí)，與板上的抗體相遇，并在最合適的比例處形成白色沉淀環(huán)。 用于沉淀反應(yīng)的抗原稱為 沉淀原 ； 用于沉淀反應(yīng)的抗體稱 沉淀素 沉淀反應(yīng)包括環(huán)狀沉淀反應(yīng)、絮狀沉淀反應(yīng)以及由此派生出來的 瓊脂擴(kuò)散免疫試驗(yàn) 等。 常用載體有人 O型紅細(xì)胞、乳膠顆粒、活性炭等，并因載體不同而分別稱為 間接血凝試驗(yàn) 、 間接乳凝試驗(yàn) 和 間接炭凝試驗(yàn) 。在該試驗(yàn) 中，將出現(xiàn)明顯凝集反應(yīng)的血清最高稀釋度稱為該抗體的效價(jià)或滴度。 用于凝集反應(yīng)的抗原稱為 凝集原 ；用于凝集反應(yīng)的抗體稱 凝集素 2. 種類 : (1)直接凝集反應(yīng) (direct agglutination) ： 顆粒性抗原直接與相應(yīng)抗體結(jié)合所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。如： 血清中和試驗(yàn)可用于檢測含量低至 103 ?g / ml的魚類病毒； ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) )可檢測含量為 103 ?g / ml的細(xì)菌性病原 6. 條件依賴性： 抗原抗體間出現(xiàn)可見反應(yīng)要提供最適的條件，如： pH值 (一般為 68)；溫度 (3745℃ )；適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì) (如生理鹽水 )； 震蕩 (增加抗原抗體相互接觸的機(jī)會(huì) )等。 Chapter 3. 免疫原理及應(yīng)用 3. 定比性： 抗原與抗體需按一定的比例結(jié)合 一般情況下，抗原表面的抗原決定簇是多價(jià)的，而抗體上的抗 原受體通常是單價(jià)的或二價(jià)的，二者只有以一定比例結(jié)合才能出現(xiàn) 可見的血清學(xué)反應(yīng)。 二、血清學(xué)反應(yīng)的特點(diǎn) 1. 特異性與交叉性： a. 特異性： 一種抗原一般只能與其相應(yīng)的抗體結(jié)合； b. 交叉性： 當(dāng)不同抗原具有相同抗原決定簇時(shí)，其結(jié)合又具有交叉性 ： a. 表面性：