生物化學(xué)合工大第四章核酸化學(xué)(參考版)
2025-01-19 12:49本頁面
【正文】 破細(xì)胞 * 去蛋白質(zhì) 酒精沉淀 去 RNA 柱層析，電泳 密度梯度離心 去多糖 三、 RNA的提取 1．不同種類 RNA的提取 2．大分子 RNA的提取 （ 1）酚提取 （ 2）酚 氯仿 SDS法 3． mRNA的提取 四、核酸純度鑒定 五、核酸含量的測定 本章重點 : 1. 核酸的化學(xué)本質(zhì)、結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本特征 。 可用 1mol/LNaCl溶液提取 DNP。 二、大分子 DNA的提取 1．材料的選擇 2．細(xì)胞破碎 3． DNA蛋白質(zhì)（ DNP）的提取 真核細(xì)胞 DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（ DNP）， RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成 RNP，而且 DNP和RNP常?；煸谝黄?。 （ 2）加強的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。 抑制 DNase： 可加檸檬酸鈉、 EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑 十二烷基硫酸鈉（ SDS）；或加蛋白變性劑。 2．防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。 核酸 的變性、復(fù)性和雜交 變性 （加熱） 探針 雜交 （緩慢冷卻） 復(fù)性 （緩慢冷卻） 分子雜交的種類 1) Southern Blot： DNADNA雜交 2) Northern Blot： DNARNA雜交 3) Western Blot：抗原 抗體進(jìn)行雜交 4) 原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光 Southern印跡法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 與放射性標(biāo)記DNA探針雜交 放射自顯影 帶有 DNA片段的凝膠 凝膠 濾膜 用緩沖液轉(zhuǎn)移 DNA 吸附有 DNA片段的膜 第五節(jié) 核酸的研究方法 一、核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意 3點 ： 1．保持低溫（ 0186。 究同源性等。 DNA溶液中加入外源 DNA單鏈分子或 RNA單鏈分子（與原 DNA具有同源性），去掉變 性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。 此外 ， DNA的復(fù)性需要 一定的鹽濃度 ， 也與它本身的組成和 結(jié)構(gòu)有關(guān) 。 退火溫度＝ Tm－ 25℃ 。 即淬火 。 ，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)， 但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。 變性 DNA分子復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時 其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。 。 可通過經(jīng)驗公式計算：（ G+C)%=() 4) Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大， 5) Tm值較低，易變性，不易保存。 2) 均一 DNA（如病毒）的 Tm值范圍較小。 5) 粘度降低，沉降系數(shù)增加。 3) DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 2) 變性改變了 DNA的二級結(jié)構(gòu)。 能夠引起核酸變性的因素有： 1）溫度升高； 2）酸堿度改變、 pH（ ）； 3）有機溶劑如甲醛和尿素、 甲酰胺 等； 4）低離子強度。 DNA易受 DNA酶作用而降 解，抽干水分的 DNA性質(zhì)十分穩(wěn)定。 DNA的紫外吸收光譜 天然 DNA 變性 DNA 核苷酸總吸收值 1 2 3 220 240 260 280 波長（ nm） 光吸收 1 2 3 根據(jù) A260/A280的比值判斷核酸樣品的 純度 純 DNA： A260/A280= 純 RNA： A260/A280= （若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則 A260/A280比值明顯降低） 純的核酸樣品可根據(jù) 260nm的光吸收值算出其 含量 若 260nm光吸收值 為 1相當(dāng)于 50μg/ml雙螺旋 DNA 或相當(dāng)于 40μg/ml單鏈 DNA或 RNA 或相當(dāng)于 20μg/ml寡核苷酸 。 3. 在細(xì)胞內(nèi)核酸分子受 DNA酶作用。 2. DNA和 RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。 2. DNA難溶于 ，可溶于 1— 2 mol/L的 NaCl溶液， RNA則相反，可據(jù)此 分離二者。 5180。 3) 已知每一個氨基酸至少有一個相應(yīng)的 tRNA。 原核生物 真核生物 核糖體 rRNA 核糖體 rRNA 30s 70s 50s 16s 5s 、 23s 40s 80s 50s 18s 5s、 、28s Transfer RNA 1) 約占總 RNA的 1015%， 分子
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