生物化學(xué)合工大第二章蛋白質(zhì)化學(xué)(參考版)
2025-01-19 11:52本頁面
【正文】 5. 用含有自由配體的溶液洗脫蛋白質(zhì) 親合層析原理及流程示意圖 三、 蛋白質(zhì)含量分析和純度鑒定 （一） 含量的測(cè)定 1. 凱氏定氮法： 2. 雙縮脲法 — 酚試劑法： a 福林 — 酚試劑包括兩組試劑：堿性銅試劑和磷鉬酸和磷鎢酸的混合試劑 b 堿性銅試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng) c 反應(yīng)后的蛋白質(zhì)的酚基在堿性條件將磷鉬酸和磷鎢酸還原為藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán) ， 藍(lán)色的深淺與蛋白含量質(zhì)成正比 。 脂糖 （ 凝膠 ） 一類的載體表面 。 3 蛋白質(zhì)提純中 ， 最廣泛和最有效的是結(jié)晶磷酸鈣即羥基磷灰石 。 PAGE垂直平板電泳示意圖 低 濃度 濃縮 膠 高 濃度 分離 膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有三種物理效應(yīng)： ①濃縮效應(yīng) ②分子篩效應(yīng) ③電荷效應(yīng) 等電聚焦電泳 ：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。 2）平板電泳：鋪有凝膠的平板上進(jìn)行的電泳。 2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作 支持物。 b. 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn) 行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。 分子大小不同 的蛋白質(zhì)所帶 凈電荷密度不同 ，遷移率不同，在電泳時(shí)可以分開。 b 有機(jī)溶劑：乙醇 、 丙酮 c 低溫操作 ， 邊加入邊攪拌 ， 防止局部過熱 ， 引 起變性 ， 盡量縮短處理時(shí)間 。 分段鹽析 ：不同蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度不同 ， 蛋白質(zhì)溶液中 ， 逐漸增大鹽濃度 ， 不同蛋白質(zhì)先后析出 ， 稱分段鹽析 。 凝膠過濾法 （ 二 ） 利用溶解度差別的分離方法 1. 等電點(diǎn)沉淀 利用各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí) ， 溶解度最小 這一性質(zhì) ， 可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的 PH 值 ， 將不同的蛋白質(zhì)分開 。 （商品名為 Sephadex)和瓊脂糖凝 膠（商品名為 Sepharose）。 ， 各種蛋白質(zhì)在不同密度介 質(zhì)中形成獨(dú)立的區(qū)帶 。 透析與超過濾簡(jiǎn)易裝置 2. 密度梯度離心 它的密度 。 （ 一 ） 根據(jù)分子大小不同的分離方法 1. 透析和超過濾 透析：根據(jù)的是蛋白質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì) ，而 水和無機(jī)鹽等小分子自由通過 ， 此方法只能 將蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開 ， 不能將不同蛋 白質(zhì)分開 。 分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì) a 等電點(diǎn)沉淀 b 鹽析和有機(jī)溶劑分級(jí)分離 純化： a 離子交換層析 b 凝膠過濾層析 c 親和層 析 d 電泳方法 結(jié)晶提純 a 多次結(jié)晶，除雜蛋白和變性蛋白 b 結(jié)晶的最佳條件：略過飽和溶液 各步驟要求條件溫和，并加少量殺菌劑。 根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)加以選擇，如 分子大小，溶 解度、電荷、吸附性質(zhì)及生物親和力 等。 ? SDS:十二烷基硫酸鈉 ，變性劑 ? 普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀） ★ 此方法只能測(cè)得亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量 ? 方法： ① 用 SDS和 巰基乙醇 （打開二硫鍵）處理 蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與 SDS結(jié)合，形成 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物，使得不同 蛋白質(zhì)分子均帶 負(fù)電 （ SDS帶負(fù)電），且 荷質(zhì)比相同 （蛋白質(zhì)分 子大，結(jié)合 SDS多；分子小，結(jié)合 SDS少）； 不同蛋白質(zhì)分子具有 相似的構(gòu)象 。 ? 聚丙烯酰胺凝膠： 單體 — 丙烯酰胺 （ acrylamide,簡(jiǎn)稱 Acr）和交聯(lián)劑 — N,N甲叉雙丙烯酰胺（ methylenebisacrylamide,簡(jiǎn)稱 Bis）在 加速劑 和催化劑 的作用下聚合而成的高分子物質(zhì)，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和分子篩性質(zhì)。 ? 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex ? 洗脫體積：自加入樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂（即收集液中該組分濃度最大時(shí)）出現(xiàn)時(shí)所流出的洗脫液體積。 ? 一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外。 ? 超速離心法既可以用來測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量也可以用作分離純化蛋白質(zhì)。 ? 相對(duì)分子質(zhì)量越大， S值越大。 離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖 轉(zhuǎn)頭 轉(zhuǎn)頭腔 沉降樣品 驅(qū)動(dòng)馬達(dá) 真
畢業(yè)設(shè)計(jì)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1