【正文】 ? 補充題 名詞解釋： 基因、 限制性核酸內(nèi)切酶 、 DNA解鏈溫度（ Tm ）、 核酸分子雜交、 PCR技術 ? 補充題 下列關于雙鏈 DNA堿基摩爾含量的關系式那一項是錯誤的？ ? ① A=T、 G=C ② A+T=G+C ? ③ A+G=C+T ④ A+C=G+T 。 ? 在親子鑒定中的應用 ? 空難、爆炸、火災等 災害事故受難者殘骸鑒定 ? 人種、性別鑒定 ? 在食品科學中 的應用一些化學方法無法鑒別性質(zhì)非常相近的成分（如橄欖油和榛木榛木油） , 轉(zhuǎn)基因食用油。其主要應用有以下幾個方面： 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 110 ? 在刑事案件中的應用 在法醫(yī)學上，如果確定某人是嫌疑犯，則可提取其血樣或毛發(fā)的 DNA，做出 DNA指紋，然后由犯罪現(xiàn)場殘留的血、精液、唾液、痰液、毛發(fā)、骨骼或其他肉體成分提取的 DNA指紋相對照。約有 30億個核苷酸構成整個染色體系統(tǒng)，沒有任何兩個人具有完全相同的核苷酸序列，這就是人的遺傳多態(tài)性。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 108 PCR在法醫(yī)學上的應用（選學） ? 目的：個體識別 ? 親子鑒定 ? 性別鑒定 ? 1985年，英國遺傳學家 Jeffreys制備出DNA指紋圖（ DNA fingerprint），其本質(zhì)為具有個體特異性的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)圖譜（ RFLP）。 ? 發(fā)酵工程：采用現(xiàn)代工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種新技術。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 107 （六）克隆基因的表達 ? 克隆基因表達就是使之在宿主細胞中獲取大量具有特定生物活性的蛋白質(zhì) 。 ? ②免疫學方法③分子雜交方法，當一個宿主細胞獲得了攜帶在載體上的基因后，細胞中往往就出現(xiàn)這一基因所編碼的蛋白質(zhì)，用免疫學方法可以檢出這種細胞。 ? 一般通過 3種方法可以取得所需要的宿主細胞： ? ①遺傳學方法，對于帶有抗藥性基因的質(zhì)粒來講，從被轉(zhuǎn)化細菌是否由敏感狀態(tài)變?yōu)榭顾幍臓顟B(tài)就可以知道它有沒有獲得這一抗藥性質(zhì)粒。包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、轉(zhuǎn)導和顯微注射、應用脂質(zhì)體或電穿孔等。第二類是 真核細胞 ，常用的有酵母菌、絲狀真菌、植物細胞、哺乳動物細胞等。 ? 受體細胞有多種 ，第一類是 原核細胞 ，目前常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等。 ? 此外，在構建 DNA重組分子中使用的工具酶還有：DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、 DNA修飾酶、 RNA修飾酶、核酸外切酶、堿性磷酸酶等。 ? 把目的基因連接到載體上去，要經(jīng)過一系列酶促反應，需要多種工具酶，最為重要的兩類酶是： ? ① DNA限制性內(nèi)切酶 把載體 DNA片段切開。 ? 通常在基因工程中選作載體的有： ? ①質(zhì)粒 —— 環(huán)狀雙鏈小型 DNA分子 ； ? ②噬菌體 —— 常用的是 λ 噬菌體； ? ③病毒 —— 例如牛痘病毒、腺病毒常用作動物細胞基因工程的載體。 ? （ 4） PCR反應合成 DNA DNA重組的基本過程 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 103 ? (二 )選擇適當?shù)妮d體 ? 外源基因（ DNA片段）很難直接透過受體細胞的細胞膜進入受體細胞，即使進入也會受到細胞內(nèi)限制性酶的作用而分解。 ? 基因克隆、 DNA重組、 ? 基因工程 (geic engineering) 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 101 基因重組的基本過程 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 102 ? （一）目的基因的制備 ? （ 1）從生物基因組 DNA中分離目的基因 ? （ 2）反轉(zhuǎn)錄法 :是先分離純化目的基因的 mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后進行 cDNA的克隆表達。 Mg2+的濃度：一般為 ~。 ? 在反應體系中加入適量（ 10%）二甲亞砜（ DMSO）可減少模板二級結構，提高 PCR反應特異性。 ? 反應混合物中 50mmol/L以內(nèi)的 KCl有利于引物退火。 ? 濃度： 。 ? 1988年 Saiki 用 Taq DNA聚合酶 （代替 Klenow酶）， 具有良好的熱穩(wěn)定性 。 ?dNTP溶液具有較強的酸性，通常把 dNTP配成5~10mmol/L貯存液，用 NaOH調(diào) pH至中性，分裝后 20℃ 凍存 。 ? 引物長度：一般以 15~30bp為宜 ? 引物擴增跨度：一般以 200~500bp為宜 ? 引物堿基分布：盡可能隨機 ? 引物堿基 G+C含量：宜在 45%~55%左右 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 95 3） 脫氧核糖核苷三磷酸（ dNTP） ?使用濃度為 50200μmol/L ?最低的適宜 dNTP濃度可根據(jù)特定靶序列長度和堿基組成來確定。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 94 2）引物 ? 引物（ primer）是 PCR特異性反應的關鍵，PCR的效率和特異性取決于兩個方面，一是引物與模板 DNA的特異結合；二是多聚酶對引物的有效延伸。 23h可以將靶序列被擴增上百萬倍 ， 達到體外擴增核酸序列的目的。 ? 1985年，美國的 Mullis等人發(fā)明了 PCR技術。對這 4組核苷酸鏈進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。生成一系列長短不一的核苷酸鏈。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 86 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 87 ? 三、核酸的核苷酸序列測定（略） ? Sanger的雙脫氧鏈終止法 ? Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（ 2ˊ,3ˊddNTP）作為鏈終止劑。 ? 加熱條件下， ? D核糖＋濃鹽酸＋ 苔黑酚 （ 3， 5二羥基甲苯） →生成綠色 ? D2脫氧核糖＋酸＋ 二苯胺 → 生成藍紫色 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 85 二 、 核酸的凝膠電泳 凝膠電泳是當前核酸研究中最常用的方法 ， 有瓊脂糖凝膠電泳 、 聚丙烯酰胺凝膠電泳 。 目前在實驗室中常常是將細胞勻漿后進行差速離心，制得細胞核、葉綠體、線粒體和核糖體等細胞器和細胞質(zhì)，然后再從這些細胞器中分離某一些 RNA。 （ 6）加入二倍體積的無水乙醇沉淀 DNA。 （ 4）通過 Rnase消化使 RNA降解。 （ 2）蛋白酶 K消化以使蛋白質(zhì)部分分解。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 82 ? 核酸分離純化的一般步驟： ? （ 1）破碎細胞； ? （ 2）除去蛋白質(zhì)、脂類、糖類等成分； ? （ 3）避免激烈攪拌和振蕩； ? （ 4）除去 RNA（或 DNA）； ? （ 5）抑制相關酶； ? （ 6）低溫操作。 ? ③防止核酸的生物降解，如使用 EDTA可以抑制DNA的活性。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 78 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 79 DNADNA 雜交雙鏈分子 變性 復性 不同來源的DNA分子 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 80 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 81 第五節(jié) 核酸的研究方法 ? 一、核酸的分離、提純和定量測定 ? （一）分離核酸的一般原則 ? 分離核酸的注意事項： ? ①盡量簡化操作步驟，減少各種因素對核酸的破壞，保證核酸一級結構的完整和天然狀態(tài)。 ? 這一術語也用以描述 雜交核酸分子的形成 。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 74 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 75 ? 問題二： ? 比較米氏常數(shù)（ Km）與 DNA解鏈溫度（ Tm）數(shù)值上的異同點？ 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 76 （二） DNA的復性 ? 指經(jīng)加熱變性的 DNA在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象，