核酸化學生物化學ppt課件(參考版)
2025-01-17 15:41本頁面
【正文】 破細胞 * 去蛋白質(zhì) 酒精沉淀 去 RNA 柱層析，電泳 密度梯度離心 去多糖 三、 RNA的提取 1．不同種類 RNA的提取 2．大分子 RNA的提取 （ 1）酚提取 （ 2）酚 氯仿 SDS法 3． mRNA的提取 四、核酸純度鑒定 五、核酸含量的測定 本章重點 : 1. 核酸的化學本質(zhì)、結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本特征 作業(yè)三： 名詞解釋：核酸的變性與復性；分子雜交； DNA 的熔解溫度；增色效應（ hyper chromic effect）；減色效應 簡答題： 1．將核酸完全水解后可得到哪些組分 ?DNA 和 RNA 的水解產(chǎn)物有何不同？ 2 P68 二、 5 。 可用 1mol/LNaCl溶液提取 DNP。 二、大分子 DNA的提取 1．材料的選擇 2．細胞破碎 3． DNA蛋白質(zhì)（ DNP）的提取 真核細胞 DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（ DNP）， RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成 RNP，而且 DNP和RNP常?；煸谝黄?。 （ 2）加強的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。 抑制 DNase： 可加檸檬酸鈉、 EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑 十二烷基硫酸鈉（ SDS）；或加蛋白變性劑。 2．防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。 核酸 的變性、復性和雜交 變性 （加熱） 探針 雜交 （緩慢冷卻） 復性 （緩慢冷卻） 分子雜交的種類 1) Southern Blot： DNADNA雜交 2) Northern Blot： DNARNA雜交 3) Western Blot：抗原 抗體進行雜交 4) 原位雜交：活體組織上進行雜交，顯出熒光 Southern印跡法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 與放射性標記DNA探針雜交 放射自顯影 帶有 DNA片段的凝膠 凝膠 濾膜 用緩沖液轉(zhuǎn)移 DNA 吸附有 DNA片段的膜 第五節(jié) 核酸的研究方法 一、核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意 3點 ： 1．保持低溫（ 0186。 究同源性等。 高于 Tm值 5℃ 復性 也稱退火 3. 影響復性的因素 ① 樣品的性質(zhì) (G+C) ② DNA的濃度 ③ DNA片段的大小 ④ 溫度 ⑤ 離子強度 DNA溶液中加入外源 DNA單鏈分子或 RNA單鏈分子（與原 DNA具有 同源性 ），去掉變 性條件后復性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。 濃度越大 ， 復性越容易 。 DNA緩慢冷卻時 ， 可以復 性 。 DNA的復性圖示 DNA驟然冷卻至低溫 時 ， DNA不可能復性 。 七、 DNA的復性 1. 概念 2. 復性的條件 3. 影響復性的因素 4. 復性動力學 5. 分子雜交 1. 概念 DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分 開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)， 其物理性質(zhì)和生物活性隨之恢復，這一過 程稱為復性； DNA，在緩慢冷卻的條件 下可重新結(jié)合恢復雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為退 火。 影響 Tm值的因素 ① DNA的均一性 ② DNA中 GC對的含量 經(jīng)驗式 : (GC)%=() ③ 鹽離子強度 增色效應與減色效應 天然 DNA分子在熱變性條件下，雙螺 旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光 260nm 波長處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為 增色效應。 溶解曲線 與 Tm。 3) 分子中 G和 C的含量越高，越不易變性，Tm值越高。 DNA解鏈溫度（熔點， Tm ） 1) 當 50% 的 DNA變性時的溫度稱為該 DNA的解鏈溫度，即增色效應達到一半時的溫度；一般 DNA的 Tm值在 7085?C之間。 DNA解鏈溫度 4) 紫外吸收值明顯增加，即 增色效應 。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結(jié)構(gòu) (堿基順序 )保持不變。 1) 變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。 六、 DNA的變性 1. 概念 2. 變性條件 3. 變性的特征 1. 概念 是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程 。 五、 DNA的穩(wěn)定性 ，但實際上 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)僵直而有剛性，易斷成 碎片，這也是目前難以獲得完整大分 子 DNA的原因。 三、兩性解離 1. 核酸含酸性的磷酸基團，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離； 2. 核酸相當于多元酸， pH大于
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