【正文】 這表明，料液pH值是決定離子交換平衡關(guān)系的一個(gè)重要因素，GSH在pH1～3范圍內(nèi)大部分以正電荷存在，所以很容易與H型的陽離子交換樹脂發(fā)生交換行為。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量，得實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量。將處理好的SephadexG10裝入柱中，柱床高度為25cm。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量，得實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。將處理好的SephadexG10裝入柱中，柱床高度為25cm。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。 SephadexG10純化GSH的研究 SephadexG10的預(yù)處理凝膠溶脹：將SephadexG10干粉室溫用10倍體積的蒸餾水充分溶脹24小時(shí)，再用沸水浴煮沸2h,攪拌后繼續(xù)用傾瀉法將不容易沉下的較細(xì)顆粒除去，直至上清液澄清為止。 SephadexG10凝膠柱的試驗(yàn)流程離子交換A柱的濃縮液上樣B柱脫鹽柱→洗脫液洗脫→測(cè)量洗脫量→B柱脫鹽柱的濃縮液上樣C柱分級(jí)分離柱→洗脫液洗脫→測(cè)量洗脫量→計(jì)算去蛋白率、濃縮倍數(shù)、純化倍數(shù)。計(jì)算GSH吸附率、損失率、洗脫率，回收率、PRO去除率等結(jié)果。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為50cm。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣后，、。(1) 準(zhǔn)備5支小層析柱，編號(hào)為x2x2x2x2x2(3) 上樣與洗滌完畢后，分別用pH=、%NaCl、1mol/LNaOH、% HCl + 。(1) 準(zhǔn)備5支小層析柱，編號(hào)為x1x1xx2x22。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣，調(diào)整最佳流速上樣完畢后，分別用去離子水、無水乙醇、15%乙醇、95%乙醇洗滌柱子雜質(zhì)。(1) 準(zhǔn)備4支小層析柱，編號(hào)為x1x1x1x17。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣后，、。 GSH上樣流速的選擇試驗(yàn)(1) 準(zhǔn)備4支小層析柱，編號(hào)為xx1x1x13 。(3) 將GSH上樣液濃度分別為初始濃度、稀釋10倍、稀釋50倍濃度的上樣液調(diào)最佳pH值后，上柱。 GSH上樣濃度的選擇試驗(yàn)(1) 準(zhǔn)備3支小層析柱，編號(hào)為xxx9 。(3) 、。 GSH上樣pH的選擇試驗(yàn)(1) 準(zhǔn)備6支小層析柱，編號(hào)為xxxxxx6 。 D001大孔樹脂分離GSH的研究(1) D001大孔樹脂的預(yù)處理：取一定量的D001大孔樹脂，用自來水反復(fù)洗滌去除 雜質(zhì)，用2mol/L的NaOH溶液浸泡洗滌(流速：)，用去離子水洗至中性，再用2mol/L HCL溶液洗滌(流速：)，再用去離子水洗至中性，最后浸泡于去離子水備用。 D001大孔樹脂離子交換柱的試驗(yàn)流程GSH的抽提液調(diào)pH →上樣→測(cè)量流出量，計(jì)算吸附率、吸附量→洗液洗滌柱子→測(cè)量漏液量，計(jì)算損失率→洗脫→測(cè)量洗脫量，計(jì)算洗脫率→洗脫液濃縮備用。 主要材料98%GSHARSigma，武漢新銳生物有限公司TrisBR中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司大孔樹脂D001BR武大弘源氨基酸廠提供SephadexG10BRSigma，武漢新銳生物有限公司DTNBARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝 主要設(shè)備BSZ100自動(dòng)部分收集器上海滬西分析儀器廠HD2000核酸蛋白檢測(cè)儀上海嘉鵬科學(xué)儀器有限公司25cm玻璃層析柱武漢華順科技實(shí)業(yè)有限公司50cm玻璃層析柱武漢華順科技實(shí)業(yè)有限公司305711便攜式記錄儀重慶川儀四廠 方法 GSH提取液的制備[65]將發(fā)酵后的啤酒酵母Y14細(xì)胞，水浴鍋中恒溫60℃，2h，8000r/min離心15min，得GSH抽提液。目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。最突出的是樣品回收率高，接近100%。而且這種方法無論應(yīng)用于脫鹽還是分級(jí)分離，都不需要蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)合，這就明顯降低了因不可逆結(jié)合所致的蛋白質(zhì)損失和失活。凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質(zhì)通過，而大分子蛋白質(zhì)及一些蛋白復(fù)合物則被阻擋在外。經(jīng)過D001分離后的GSH粗品中還含有蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)，要得到較高純度的GSH產(chǎn)品，還要防止GSH被氧化失活，其難度大、成本高。近年來，已有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用D001純化GSH，如邱雁臨，胡靜等[43]對(duì)大孔樹脂D001分離啤酒廢酵母中的GSH進(jìn)行了研究在最佳分離條件下，大孔樹脂D001分離GSH %，產(chǎn)品中GSH %。按照離子交換原理，蛋白質(zhì)可從大量洗脫液中被分離，所以此方法尤適于蛋白質(zhì)粗提物的初始純化[61]。比較發(fā)現(xiàn)，菌體干重、%、%。 結(jié)論(1) 第一批自動(dòng)生物發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，20h時(shí)添加前體氨基酸和ATP的方法，測(cè)得GSH的產(chǎn)量在52h時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值243mg/L。(2) 當(dāng)菌體干重達(dá)到最大值時(shí)再加入前體氨基酸和ATP,使GSH在胞內(nèi)大量合成，從而提高GSH產(chǎn)量。 補(bǔ)料培養(yǎng)進(jìn)程曲線繪制，綜合上述二批發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果分析如下：經(jīng)過一批發(fā)酵罐培養(yǎng)所得數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)菌體干重增長(zhǎng)緩慢且均值很低，導(dǎo)致GSH產(chǎn)量不高，原因是只加入單一葡萄糖補(bǔ)充菌體生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，再加上發(fā)酵20h時(shí)加入合成GSH所需前體氨基酸和ATP后，發(fā)酵液溶氧濃度在30min內(nèi)迅速上升至100%，說明菌體細(xì)胞不再好氧，這在很大程度上，嚴(yán)重抑制了菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)。 GSH含量曲線繪制，當(dāng)36h加入補(bǔ)料培養(yǎng)基后，GSH含量明顯升高。 殘?zhí)乔€繪制 菌體干重曲線繪制二批發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體，由于全料流加培養(yǎng)基的加入和避免在20h時(shí)前體氨基酸和ATP的加入，0～，%。 第二批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) pH曲線繪制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pH逐漸下降，并維持恒定至發(fā)酵結(jié)束。再加上在培養(yǎng)20h后，前體氨基酸和ATP的添加，使得菌體細(xì)胞內(nèi)GSH的含量呈明顯上升趨勢(shì)，但是L半胱氨酸加入嚴(yán)重抑制了菌體細(xì)胞的增長(zhǎng)，使罐內(nèi)溶氧在補(bǔ)料培養(yǎng)基加入30min內(nèi)達(dá)到100%，且溶氧穩(wěn)定，說明此時(shí)菌體細(xì)胞停止生長(zhǎng)，從而發(fā)酵液中GSH的產(chǎn)量雖呈上升趨勢(shì)，但產(chǎn)量均值不高。 補(bǔ)料培養(yǎng)進(jìn)程曲線繪制，綜合上述一批發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如下：在發(fā)酵初期階段，殘?zhí)菨舛认陆岛芸?，由于碳源的消耗殆盡，惡劣的環(huán)境會(huì)嚴(yán)重阻遏菌體的生長(zhǎng)繁殖和菌體細(xì)胞的富集，從而目的產(chǎn)物也無法高效積累，故發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量也會(huì)因此嚴(yán)重下降。 GSH含量曲線繪制當(dāng)菌體培養(yǎng)20h發(fā)酵罐補(bǔ)加前體氨基酸和ATP后，菌體細(xì)胞中GSH含量呈明顯上升趨勢(shì)且在培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到52h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH含量達(dá)到最大值。 菌體干重曲線繪制，在發(fā)酵罐培養(yǎng)12h流加培養(yǎng)基后，12h～16h發(fā)酵罐菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速富集生長(zhǎng)，16h～44h菌體細(xì)胞呈現(xiàn)穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)，菌體干重最高值達(dá)8g/L。 殘?zhí)乔€繪制發(fā)酵液中的糖濃度是影響菌體生長(zhǎng)的重要因素，當(dāng)殘?zhí)菨舛绕蜁r(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)物形成率也開始變低，因此，若在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候流加培養(yǎng)液，從而達(dá)到高密度培養(yǎng)的效果。當(dāng)20h時(shí)向發(fā)酵罐中加入L谷氨酸，L半胱氨酸，甘氨酸，ATP后，溶氧濃度迅速上升至100%，并維持此濃度至發(fā)酵結(jié)束。 結(jié)果與討論 第一批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) pH曲線繪制，0～，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，隨后保持恒定。2) 細(xì)胞GSH含量的分析：發(fā)酵液經(jīng)離心洗滌干凈后得菌體，用凍融法破壁后，經(jīng)722型可見分光光度計(jì)，DTNB法測(cè)胞內(nèi)GSH含量。每隔8h從發(fā)酵罐的取樣口中取出一定量的發(fā)酵液，測(cè)定其殘?zhí)菨舛?、菌體干重及GSH含量，當(dāng)菌體干重達(dá)到最大值時(shí)加入補(bǔ)料培養(yǎng)基，并利用發(fā)酵罐的在線檢測(cè)，讀出發(fā)酵液pH值，將他們繪制成曲線。每隔8h從發(fā)酵罐的取樣口中取出一定量的發(fā)酵液，測(cè)定其殘?zhí)菨舛?、菌體干重及GSH含量，并利用發(fā)酵罐的在線檢測(cè)，讀出發(fā)酵液pH值，將他們繪制成曲線。 (2)培養(yǎng)溫度恒定為30℃。 二級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)用無菌10mL移液管吸取10mL新鮮一級(jí)種子培養(yǎng)液接入裝有100mL二級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，在培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)12h。 主要儀器BIOTECH10100JS發(fā)酵罐上海保興生物設(shè)備工程有限公司SBA40C生物傳感分析儀山東省科學(xué)院生物研究所 方法 斜面種子培養(yǎng)從保藏斜面中取一環(huán)菌種劃線于新鮮斜面培養(yǎng)基上，后置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 B流加培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖50，酵母膏 25，(NH4)2SO4 20，KH2PO4 ，MgSO4 ，水1000mL。 補(bǔ)料培養(yǎng)基L谷氨酸10mmol/L，甘氨酸6mmol/L，L半胱氨酸10mmol/L，ATP 。 二級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，NacL 5，裝量50/500mL，水1000mL。 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 10，瓊脂20。本章利用10L自動(dòng)生物發(fā)酵罐初步研究了啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH的擴(kuò)大發(fā)酵。經(jīng)過大量的試驗(yàn)表明，微生物的補(bǔ)料培養(yǎng)是提高菌體生物量和GSH產(chǎn)量的較好辦法，補(bǔ)料培養(yǎng)成功的關(guān)鍵是補(bǔ)料策略的選擇，也就是根據(jù)生產(chǎn)的生長(zhǎng)特點(diǎn)確定合理的補(bǔ)料時(shí)間，從而使發(fā)酵液中生物量大量積累。因此適量的流加策略對(duì)補(bǔ)料培養(yǎng)至關(guān)重要。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，必須加大底物(如葡萄糖)的質(zhì)量濃度。第4章10L自動(dòng)發(fā)酵罐擴(kuò)大發(fā)酵的初探在自動(dòng)發(fā)酵罐分批培養(yǎng)過程中，由于營(yíng)養(yǎng)的耗盡和阻遏物的積累，生物量和產(chǎn)物在培養(yǎng)一段時(shí)期后將達(dá)到不再增加的穩(wěn)定狀態(tài)，如果能除去這兩方面對(duì)微生物生長(zhǎng)的限制，微生物就有可能達(dá)到高密度富集[59]。 結(jié)論啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH的最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速180rpm、搖瓶裝液量30mL/300mL、補(bǔ)料培養(yǎng)基添加時(shí)間20h；最佳培養(yǎng)基組成是：葡萄糖20g/L, 酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 ，在此試驗(yàn)條件下，目前為國(guó)內(nèi)所查文獻(xiàn)報(bào)道最高水平（陜西省微生物研究所詹谷宇[27]等篩得的突變株KllUE 126，是國(guó)內(nèi)所查文獻(xiàn)報(bào)道最高水平，Kono[28]%，為目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中GSH含量最高水平。綜上所述，在培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速180rpm條件下，按照袁宏麗[58]采用正交試驗(yàn)與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法相結(jié)合確定添加前體氨基酸和調(diào)節(jié)因子ATP的最優(yōu)方案，在20h加入補(bǔ)料培養(yǎng)基：L谷氨酸10mmol/L，甘氨酸6mmol/L，L半胱氨酸10mmol/L，ATP ，測(cè)定整個(gè)發(fā)酵過程的各項(xiàng)指標(biāo)變化。如果胞內(nèi)的這些前體物質(zhì)不能滿足GSH合成的需要，就將成為進(jìn)一步提高GSH產(chǎn)量的限制性因素[57]。 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH進(jìn)程曲線的繪制GSH在生物體內(nèi)是由γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH Ⅱ)在ATP存在的條件下，催化L谷氨酸、L半胱氨酸和甘氨酸進(jìn)行序貫反應(yīng)而形成的[56]。 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 改變搖瓶裝液量會(huì)影響發(fā)酵液的溶氧濃度，從而影響菌體對(duì)GSH的積累。 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果氧是構(gòu)成細(xì)胞本身及其代謝產(chǎn)物的成分之一，雖然培養(yǎng)基中大量存在的水及其他成分可以提供氧元素，但許多微生物細(xì)胞必須利用分子態(tài)的氧作為呼吸鏈電子系統(tǒng)末端的電子受體，在電子傳遞過程中釋放出大量能量供細(xì)胞維持生長(zhǎng)和代謝作用，氧是一種難溶氣體，在室溫和常壓條件下，純氧的溶解度僅為36mg/L，空氣中氧的溶解度僅為8mg/L，當(dāng)水中溶有糖和其它物質(zhì)時(shí)，氧的溶解度更低，啤酒酵母Y14的發(fā)酵過程是好氧發(fā)酵過程，因此，在它發(fā)酵時(shí)必須不斷的向培養(yǎng)液供給足夠的氧以滿足其生長(zhǎng)代謝的需要，但過大的溶氧又會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)代謝，因此，適宜的溶氧能提高代謝產(chǎn)物的濃度，而在實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵過程中溶氧濃度是通過搖床轉(zhuǎn)速控制的。 發(fā)酵初始pH值的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果發(fā)酵液的pH除了對(duì)細(xì)胞發(fā)生直接影響之外，如影響細(xì)胞的通透性，還對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的間接影響，例如，影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響環(huán)境中有害物質(zhì)對(duì)微生物的毒性，以及影響代謝反應(yīng)中各種酶的活性等，因此，發(fā)酵液的pH也是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的最重要因素之一。一般而言，隨著溫度的增加，生長(zhǎng)速率也會(huì)增加，但機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸等對(duì)溫度都比較敏感，如果溫度上升到一定程度將會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響，此外，過高或過低的溫度都會(huì)使細(xì)胞膜的正常功能喪失，因此，應(yīng)選擇最適的培養(yǎng)溫度。此時(shí)。 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果，GSH產(chǎn)量的最大值出現(xiàn)在60h，60h后GSH產(chǎn)量開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)；而生物量在52h達(dá)到最大，52h后趨于穩(wěn)定；GSH含量在60h達(dá)到最大，60h后變化甚微。觀察整個(gè)發(fā)酵過程的各項(xiàng)指標(biāo)變化。 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)在其他發(fā)酵條件不變時(shí)，考察了當(dāng)搖瓶裝液量分別為30mL/300mL、50mL/300mL、70mL/300mL、90mL/300mL、110mL/300mL時(shí)，Y14酵母菌產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗(yàn)在其他發(fā)酵條件不變時(shí)，、7時(shí)，啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)啤酒酵母Y14連續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，后每隔8小時(shí)取樣測(cè)量生物量及GSH產(chǎn)量。 主要試劑L谷氨酸BR中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司L半胱氨酸