【正文】 得干凈菌體，置于烘箱中，于105℃烘干至恒重，稱量。2) 細胞GSH含量的分析：發(fā)酵液經(jīng)離心洗滌干凈后得菌體，用凍融法破壁后，經(jīng)722型可見分光光度計，DTNB法測胞內GSH含量。3) 發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊臏y定：采用SBA40C生物傳感分析儀測定殘?zhí)菨舛取?結果與討論 第一批發(fā)酵罐補料培養(yǎng) pH曲線繪制，0～，隨著發(fā)酵時間的延長，隨后保持恒定。 溶氧曲線繪制，發(fā)酵液初始溶氧濃度為100%，0～20h之間，菌體進入對數(shù)生長期，快速好氧生長，溶氧濃度迅速下降到1%。當20h時向發(fā)酵罐中加入L谷氨酸，L半胱氨酸，甘氨酸，ATP后，溶氧濃度迅速上升至100%，并維持此濃度至發(fā)酵結束。因為前體氨基酸的添加，尤其是L半胱氨酸的添加嚴重抑制菌體細胞生長，但GSH的含量仍在增加。 殘?zhí)乔€繪制發(fā)酵液中的糖濃度是影響菌體生長的重要因素，當殘?zhí)菨舛绕蜁r，菌體生長緩慢，產(chǎn)物形成率也開始變低，因此，若在適當?shù)臅r候流加培養(yǎng)液，從而達到高密度培養(yǎng)的效果。%左右時流加培養(yǎng)液，%～%之間。 菌體干重曲線繪制，在發(fā)酵罐培養(yǎng)12h流加培養(yǎng)基后，12h～16h發(fā)酵罐菌體進入對數(shù)生長期，細胞快速富集生長，16h～44h菌體細胞呈現(xiàn)穩(wěn)定生長狀態(tài)，菌體干重最高值達8g/L。44h后菌體細胞進入衰亡期，細胞呈逐步緩慢下降趨勢。 GSH含量曲線繪制當菌體培養(yǎng)20h發(fā)酵罐補加前體氨基酸和ATP后，菌體細胞中GSH含量呈明顯上升趨勢且在培養(yǎng)時間達到52h時，細胞內GSH含量達到最大值。 GSH產(chǎn)量曲線繪制隨著發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體20h前體氨基酸和ATP的加入，菌體的干重基本保持穩(wěn)定，但菌體內GSH含量呈明顯上升趨勢，GSH的產(chǎn)量也呈顯著上升趨勢，且在52h時，產(chǎn)量達到最大值243mg/L。 補料培養(yǎng)進程曲線繪制，綜合上述一批發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗結果分析如下：在發(fā)酵初期階段，殘?zhí)菨舛认陆岛芸?，由于碳源的消耗殆盡，惡劣的環(huán)境會嚴重阻遏菌體的生長繁殖和菌體細胞的富集，從而目的產(chǎn)物也無法高效積累，故發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量也會因此嚴重下降。而自動生物發(fā)酵罐補料培養(yǎng)的優(yōu)越性就主要體現(xiàn)在此，培養(yǎng)12h后，測得發(fā)酵液殘?zhí)菨舛鹊椭?%以下，流加培養(yǎng)基，使殘?zhí)菨舛缺３衷?%～%之間，菌體細胞濃度持續(xù)增加，趨于穩(wěn)定。再加上在培養(yǎng)20h后，前體氨基酸和ATP的添加，使得菌體細胞內GSH的含量呈明顯上升趨勢，但是L半胱氨酸加入嚴重抑制了菌體細胞的增長，使罐內溶氧在補料培養(yǎng)基加入30min內達到100%，且溶氧穩(wěn)定，說明此時菌體細胞停止生長，從而發(fā)酵液中GSH的產(chǎn)量雖呈上升趨勢，但產(chǎn)量均值不高。綜上所述，啤酒酵母Y1410L自動生物發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)，在其發(fā)酵過程中采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，和在20h時添加前體氨基酸和ATP的方法效果并不顯著，方法有待改進。 第二批發(fā)酵罐補料培養(yǎng) pH曲線繪制，隨著時間的延長，pH逐漸下降，并維持恒定至發(fā)酵結束。 溶氧曲線繪制，發(fā)酵液初始溶氧濃度為100%，0～8h之間，溶氧濃度迅速下降至8%，8～36h之間，%，為了避免氨基酸和ATP對菌體生長的抑制，故推延至36h時，再加入前體氨基酸和ATP，36h后至發(fā)酵結束，溶氧濃度維持100%恒定。 殘?zhí)乔€繪制 菌體干重曲線繪制二批發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體，由于全料流加培養(yǎng)基的加入和避免在20h時前體氨基酸和ATP的加入，0～，%。后開始自溶進入衰亡期。 GSH含量曲線繪制，當36h加入補料培養(yǎng)基后，GSH含量明顯升高。 GSH產(chǎn)量曲線繪制當發(fā)酵36h時，菌體干重達到最大值，此時加入補料培養(yǎng)基，有助于菌體細胞內GSH的合成。 補料培養(yǎng)進程曲線繪制，綜合上述二批發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗結果分析如下：經(jīng)過一批發(fā)酵罐培養(yǎng)所得數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)菌體干重增長緩慢且均值很低，導致GSH產(chǎn)量不高，原因是只加入單一葡萄糖補充菌體生長所需營養(yǎng)還遠遠不足，再加上發(fā)酵20h時加入合成GSH所需前體氨基酸和ATP后，發(fā)酵液溶氧濃度在30min內迅速上升至100%，說明菌體細胞不再好氧，這在很大程度上，嚴重抑制了菌體細胞的生長。為了解決上述兩個問題，在二批發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，做了相應調整：(1)流加培養(yǎng)基為全料培養(yǎng)基，即包含了菌體生長所需的全部營養(yǎng)。(2) 當菌體干重達到最大值時再加入前體氨基酸和ATP,使GSH在胞內大量合成，從而提高GSH產(chǎn)量。結果發(fā)現(xiàn)，菌體干重、%、%。 結論(1) 第一批自動生物發(fā)酵罐補料培養(yǎng)采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，20h時添加前體氨基酸和ATP的方法，測得GSH的產(chǎn)量在52h時，產(chǎn)量達到最大值243mg/L。(2) 第二批自動生物發(fā)酵罐補料培養(yǎng)采用恒速流加全料培養(yǎng)基，36h時添加補料培養(yǎng)基的方法。比較發(fā)現(xiàn)，菌體干重、%、%。第5章 啤酒酵母Y14中還原型GSH的分離純化離子交換層析是最為廣泛的蛋白質純化手段。按照離子交換原理，蛋白質可從大量洗脫液中被分離，所以此方法尤適于蛋白質粗提物的初始純化[61]。大孔樹脂D001為大孔型強酸性陽離子交換樹脂[62]，它根據(jù)混合物中目的蛋白和雜質之間所帶電荷性質不同而將其分離開來。近年來，已有少數(shù)文獻報道，利用D001純化GSH，如邱雁臨，胡靜等[43]對大孔樹脂D001分離啤酒廢酵母中的GSH進行了研究在最佳分離條件下，大孔樹脂D001分離GSH %，產(chǎn)品中GSH %。蘇曉晉，王淼等[45]%，蛋白質去除率60%，，獲得了良好的分離效果。經(jīng)過D001分離后的GSH粗品中還含有蛋白質、氨基酸、核苷酸等物質，要得到較高純度的GSH產(chǎn)品，還要防止GSH被氧化失活，其難度大、成本高。凝膠過濾層析是一項重要的蛋白質純化技術，又稱為大小排阻、凝膠排阻、分子篩或凝膠過濾層析[63]。凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白質分子大小差異進行分離的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白質及一些蛋白復合物則被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質在填料顆粒間隙中流動，比低分子量蛋白質更早地被洗脫下來[64]。而且這種方法無論應用于脫鹽還是分級分離，都不需要蛋白質的化學結合，這就明顯降低了因不可逆結合所致的蛋白質損失和失活。另外，它分離純化效果好、重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。本章分別選用D001大孔樹脂、SephadexG10凝膠雙柱法對GSH抽提液進行分離、精制等過程研究，以提高GSH回收率、蛋白質去除率等指標。目前未見文獻報道。 材料 菌種啤酒酵母Y14，由XXXX大學工業(yè)微生物湖北省重點實驗室再生資源微生物轉化研究室提供。 主要材料98%GSHARSigma，武漢新銳生物有限公司TrisBR中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司大孔樹脂D001BR武大弘源氨基酸廠提供SephadexG10BRSigma，武漢新銳生物有限公司DTNBARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝 主要設備BSZ100自動部分收集器上海滬西分析儀器廠HD2000核酸蛋白檢測儀上海嘉鵬科學儀器有限公司25cm玻璃層析柱武漢華順科技實業(yè)有限公司50cm玻璃層析柱武漢華順科技實業(yè)有限公司305711便攜式記錄儀重慶川儀四廠 方法 GSH提取液的制備[65]將發(fā)酵后的啤酒酵母Y14細胞，水浴鍋中恒溫60℃，2h，8000r/min離心15min，得GSH抽提液。 檢測方法(PRO)[66] DTNB法檢測GSH含量 相關數(shù)據(jù)的計算公式吸附率＝(上樣含量流出液含量)/原液量100 %洗雜質損失率= 泄露含量/上樣吸附含量100 %洗脫率＝(洗脫液中濃度洗脫液體積)/ (吸附量泄露量)100 %回收率＝洗脫液中含量/原液含量100 %濃縮倍數(shù)＝洗脫液中濃度/原液濃度純化倍數(shù)＝(洗脫液中GSH濃度/蛋白質濃度)/(原液中 GSH 濃度/蛋白質濃度)以上計算方法適用于GSH和PRO。 D001大孔樹脂離子交換柱的試驗流程GSH的抽提液調pH →上樣→測量流出量，計算吸附率、吸附量→洗液洗滌柱子→測量漏液量，計算損失率→洗脫→測量洗脫量，計算洗脫率→洗脫液濃縮備用。并研究上柱和洗脫的工藝參數(shù)。 D001大孔樹脂分離GSH的研究(1) D001大孔樹脂的預處理：取一定量的D001大孔樹脂，用自來水反復洗滌去除 雜質，用2mol/L的NaOH溶液浸泡洗滌(流速：)，用去離子水洗至中性，再用2mol/L HCL溶液洗滌(流速：)，再用去離子水洗至中性，最后浸泡于去離子水備用。(2) 大孔樹脂的再生方法：用2倍體積2%～4% NaOH 溶液浸泡樹脂4h，再采用2 mol/L的HCl浸泡、攪拌2h 以上，用去離子水清洗至中性。 GSH上樣pH的選擇試驗(1) 準備6支小層析柱，編號為xxxxxx6 。(2) 將處理好的D001樹脂依次裝入上述6支柱中。(3) 、、。(4) DTNB法分別測量各柱流出液GSH含量，計算吸附率。 GSH上樣濃度的選擇試驗(1) 準備3支小層析柱，編號為xxx9 。(2) 將處理好的D001樹脂依次裝入上述3支柱中。(3) 將GSH上樣液濃度分別為初始濃度、稀釋10倍、稀釋50倍濃度的上樣液調最佳pH值后，上柱。(4) DTNB法分別測量各柱流出液GSH含量，計算吸附率。 GSH上樣流速的選擇試驗(1) 準備4支小層析柱，編號為xx1x1x13 。(2) 將處理好的D001樹脂依次裝入上述4支柱中。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣后，、。(4) DTNB法分別測量各柱流出液GSH含量，計算吸附率。(1) 準備4支小層析柱，編號為x1x1x1x17。(2) 將處理好的D001樹脂依次裝入上述4支柱中。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣，調整最佳流速上樣完畢后，分別用去離子水、無水乙醇、15%乙醇、95%乙醇洗滌柱子雜質。(4) DTNB法分別測量各柱流出液GSH含量，計算損失率。(1) 準備5支小層析柱，編號為x1x1xx2x22。(2) 將處理好的D001樹脂依次裝入上述5支柱中。(3) 上樣與洗滌完畢后，分別用pH=、%NaCl、1mol/LNaOH、% HCl + 。(4) DTNB法分別測量各柱流出液GSH含量，計算洗脫率。(1) 準備5支小層析柱，編號為x2x2x2x2x2(2) 將處理好的D001樹脂依次裝入上述5支柱中。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣后，、。 D001大孔樹脂分離GSH重復放大試驗(1) 50cm玻璃層析柱1支，編號A柱。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為50cm。(2) 、pH=3上樣60mL，用無水乙醇洗滌雜質，+，流速為3mL/min, DTNB法檢測洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測PRO含量。計算GSH吸附率、損失率、洗脫率，回收率、PRO去除率等結果。(3) 重復三次試驗，計算得出結果平均值。 SephadexG10凝膠柱的試驗流程離子交換A柱的濃縮液上樣B柱脫鹽柱→洗脫液洗脫→測量洗脫量→B柱脫鹽柱的濃縮液上樣C柱分級分離柱→洗脫液洗脫→測量洗脫量→計算去蛋白率、濃縮倍數(shù)、純化倍數(shù)。并研究上柱和洗脫的工藝參數(shù)。 SephadexG10純化GSH的研究 SephadexG10的預處理凝膠溶脹：將SephadexG10干粉室溫用10倍體積的蒸餾水充分溶脹24小時，再用沸水浴煮沸2h,攪拌后繼續(xù)用傾瀉法將不容易沉下的較細顆粒除去，直至上清液澄清為止。 SephadexG10（脫鹽）GSH上樣濃度的選擇試驗(1) 25cm玻璃層析柱2支，編號BB2柱。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) 將B柱洗脫濃縮液分別按初始濃度、稀釋10倍濃度依次上樣BB2柱。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量。 GSH上樣體積的選擇試驗(1) 25cm玻璃層析柱5支，編號BBBBB7柱。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) 將B柱洗脫濃縮液按最佳濃度，分別上樣10mL、20mL、30mL、40mL、50mL。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量。 SephadexG10（脫鹽）重復試驗(1) 25cm玻璃層析柱1支，編號B8柱。將處理好的SephadexG10裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) ,上樣體積為20mL。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量，得實驗結果平均值。 SephadexG10（分級分離）GSH上樣體積的選擇試驗(1) 25cm玻璃層析柱3支，編號CCC3柱。將處理好的SephadexG10裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) 、分別上樣2mL、5mL、10mL。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量。 SephadexG10（分級分離）重復試驗(1) 25cm玻璃層析柱1支，編號C4柱。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) ，上樣體積為2mL。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量，得實驗結果平均值。 D001大孔樹脂分離GSH的研究結果 GSH上樣pH的選擇試驗結果，當pH3時，吸附容量隨著pH值的升高而增加，在pH=3時吸附容量達到最大值，之后隨著pH值的升高而減小。這表明，料液pH值是決定離子交換平衡關系的一個重要因素，GSH在pH1～3范圍內大部分以正電荷存在，所以很容易與H型的陽離子交換樹脂發(fā)生交換行為。這是由于