【正文】 期，快速好氧生長(zhǎng)，溶氧濃度迅速下降到1%。當(dāng)20h時(shí)向發(fā)酵罐中加入L谷氨酸，L半胱氨酸，甘氨酸，ATP后，溶氧濃度迅速上升至100%，并維持此濃度至發(fā)酵結(jié)束。因?yàn)榍绑w氨基酸的添加，尤其是L半胱氨酸的添加嚴(yán)重抑制菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，但GSH的含量仍在增加。 殘?zhí)乔€繪制發(fā)酵液中的糖濃度是影響菌體生長(zhǎng)的重要因素，當(dāng)殘?zhí)菨舛绕蜁r(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)物形成率也開(kāi)始變低，因此，若在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候流加培養(yǎng)液，從而達(dá)到高密度培養(yǎng)的效果。%左右時(shí)流加培養(yǎng)液，%～%之間。 菌體干重曲線繪制，在發(fā)酵罐培養(yǎng)12h流加培養(yǎng)基后，12h～16h發(fā)酵罐菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速富集生長(zhǎng)，16h～44h菌體細(xì)胞呈現(xiàn)穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)，菌體干重最高值達(dá)8g/L。44h后菌體細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞呈逐步緩慢下降趨勢(shì)。 GSH含量曲線繪制當(dāng)菌體培養(yǎng)20h發(fā)酵罐補(bǔ)加前體氨基酸和ATP后，菌體細(xì)胞中GSH含量呈明顯上升趨勢(shì)且在培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到52h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH含量達(dá)到最大值。 GSH產(chǎn)量曲線繪制隨著發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體20h前體氨基酸和ATP的加入，菌體的干重基本保持穩(wěn)定，但菌體內(nèi)GSH含量呈明顯上升趨勢(shì)，GSH的產(chǎn)量也呈顯著上升趨勢(shì)，且在52h時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值243mg/L。 補(bǔ)料培養(yǎng)進(jìn)程曲線繪制，綜合上述一批發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如下：在發(fā)酵初期階段，殘?zhí)菨舛认陆岛芸?，由于碳源的消耗殆盡，惡劣的環(huán)境會(huì)嚴(yán)重阻遏菌體的生長(zhǎng)繁殖和菌體細(xì)胞的富集，從而目的產(chǎn)物也無(wú)法高效積累，故發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量也會(huì)因此嚴(yán)重下降。而自動(dòng)生物發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)的優(yōu)越性就主要體現(xiàn)在此，培養(yǎng)12h后，測(cè)得發(fā)酵液殘?zhí)菨舛鹊椭?%以下，流加培養(yǎng)基，使殘?zhí)菨舛缺３衷?%～%之間，菌體細(xì)胞濃度持續(xù)增加，趨于穩(wěn)定。再加上在培養(yǎng)20h后，前體氨基酸和ATP的添加，使得菌體細(xì)胞內(nèi)GSH的含量呈明顯上升趨勢(shì)，但是L半胱氨酸加入嚴(yán)重抑制了菌體細(xì)胞的增長(zhǎng)，使罐內(nèi)溶氧在補(bǔ)料培養(yǎng)基加入30min內(nèi)達(dá)到100%，且溶氧穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)菌體細(xì)胞停止生長(zhǎng)，從而發(fā)酵液中GSH的產(chǎn)量雖呈上升趨勢(shì)，但產(chǎn)量均值不高。綜上所述，啤酒酵母Y1410L自動(dòng)生物發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)，在其發(fā)酵過(guò)程中采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，和在20h時(shí)添加前體氨基酸和ATP的方法效果并不顯著，方法有待改進(jìn)。 第二批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) pH曲線繪制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pH逐漸下降，并維持恒定至發(fā)酵結(jié)束。 溶氧曲線繪制，發(fā)酵液初始溶氧濃度為100%，0～8h之間，溶氧濃度迅速下降至8%，8～36h之間，%，為了避免氨基酸和ATP對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，故推延至36h時(shí)，再加入前體氨基酸和ATP，36h后至發(fā)酵結(jié)束，溶氧濃度維持100%恒定。 殘?zhí)乔€繪制 菌體干重曲線繪制二批發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體，由于全料流加培養(yǎng)基的加入和避免在20h時(shí)前體氨基酸和ATP的加入，0～，%。后開(kāi)始自溶進(jìn)入衰亡期。 GSH含量曲線繪制，當(dāng)36h加入補(bǔ)料培養(yǎng)基后，GSH含量明顯升高。 GSH產(chǎn)量曲線繪制當(dāng)發(fā)酵36h時(shí)，菌體干重達(dá)到最大值，此時(shí)加入補(bǔ)料培養(yǎng)基，有助于菌體細(xì)胞內(nèi)GSH的合成。 補(bǔ)料培養(yǎng)進(jìn)程曲線繪制，綜合上述二批發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果分析如下：經(jīng)過(guò)一批發(fā)酵罐培養(yǎng)所得數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)菌體干重增長(zhǎng)緩慢且均值很低，導(dǎo)致GSH產(chǎn)量不高，原因是只加入單一葡萄糖補(bǔ)充菌體生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，再加上發(fā)酵20h時(shí)加入合成GSH所需前體氨基酸和ATP后，發(fā)酵液溶氧濃度在30min內(nèi)迅速上升至100%，說(shuō)明菌體細(xì)胞不再好氧，這在很大程度上，嚴(yán)重抑制了菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了解決上述兩個(gè)問(wèn)題，在二批發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中，做了相應(yīng)調(diào)整：(1)流加培養(yǎng)基為全料培養(yǎng)基，即包含了菌體生長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng)。(2) 當(dāng)菌體干重達(dá)到最大值時(shí)再加入前體氨基酸和ATP,使GSH在胞內(nèi)大量合成，從而提高GSH產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌體干重、%、%。 結(jié)論(1) 第一批自動(dòng)生物發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，20h時(shí)添加前體氨基酸和ATP的方法，測(cè)得GSH的產(chǎn)量在52h時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值243mg/L。(2) 第二批自動(dòng)生物發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)采用恒速流加全料培養(yǎng)基，36h時(shí)添加補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。比較發(fā)現(xiàn)，菌體干重、%、%。第5章 啤酒酵母Y14中還原型GSH的分離純化離子交換層析是最為廣泛的蛋白質(zhì)純化手段。按照離子交換原理，蛋白質(zhì)可從大量洗脫液中被分離，所以此方法尤適于蛋白質(zhì)粗提物的初始純化[61]。大孔樹(shù)脂D001為大孔型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂[62]，它根據(jù)混合物中目的蛋白和雜質(zhì)之間所帶電荷性質(zhì)不同而將其分離開(kāi)來(lái)。近年來(lái)，已有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用D001純化GSH，如邱雁臨，胡靜等[43]對(duì)大孔樹(shù)脂D001分離啤酒廢酵母中的GSH進(jìn)行了研究在最佳分離條件下，大孔樹(shù)脂D001分離GSH %，產(chǎn)品中GSH %。蘇曉晉，王淼等[45]%，蛋白質(zhì)去除率60%，，獲得了良好的分離效果。經(jīng)過(guò)D001分離后的GSH粗品中還含有蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)，要得到較高純度的GSH產(chǎn)品，還要防止GSH被氧化失活，其難度大、成本高。凝膠過(guò)濾層析是一項(xiàng)重要的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，又稱為大小排阻、凝膠排阻、分子篩或凝膠過(guò)濾層析[63]。凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離的，凝膠過(guò)濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質(zhì)通過(guò)，而大分子蛋白質(zhì)及一些蛋白復(fù)合物則被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質(zhì)在填料顆粒間隙中流動(dòng)，比低分子量蛋白質(zhì)更早地被洗脫下來(lái)[64]。而且這種方法無(wú)論應(yīng)用于脫鹽還是分級(jí)分離，都不需要蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)合，這就明顯降低了因不可逆結(jié)合所致的蛋白質(zhì)損失和失活。另外，它分離純化效果好、重復(fù)性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。本章分別選用D001大孔樹(shù)脂、SephadexG10凝膠雙柱法對(duì)GSH抽提液進(jìn)行分離、精制等過(guò)程研究，以提高GSH回收率、蛋白質(zhì)去除率等指標(biāo)。目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。 材料 菌種啤酒酵母Y14，由XXXX大學(xué)工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室再生資源微生物轉(zhuǎn)化研究室提供。 主要材料98%GSHARSigma，武漢新銳生物有限公司TrisBR中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司大孔樹(shù)脂D001BR武大弘源氨基酸廠提供SephadexG10BRSigma，武漢新銳生物有限公司DTNBARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝 主要設(shè)備BSZ100自動(dòng)部分收集器上海滬西分析儀器廠HD2000核酸蛋白檢測(cè)儀上海嘉鵬科學(xué)儀器有限公司25cm玻璃層析柱武漢華順科技實(shí)業(yè)有限公司50cm玻璃層析柱武漢華順科技實(shí)業(yè)有限公司305711便攜式記錄儀重慶川儀四廠 方法 GSH提取液的制備[65]將發(fā)酵后的啤酒酵母Y14細(xì)胞，水浴鍋中恒溫60℃，2h，8000r/min離心15min，得GSH抽提液。 檢測(cè)方法(PRO)[66] DTNB法檢測(cè)GSH含量 相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算公式吸附率＝(上樣含量流出液含量)/原液量100 %洗雜質(zhì)損失率= 泄露含量/上樣吸附含量100 %洗脫率＝(洗脫液中濃度洗脫液體積)/ (吸附量泄露量)100 %回收率＝洗脫液中含量/原液含量100 %濃縮倍數(shù)＝洗脫液中濃度/原液濃度純化倍數(shù)＝(洗脫液中GSH濃度/蛋白質(zhì)濃度)/(原液中 GSH 濃度/蛋白質(zhì)濃度)以上計(jì)算方法適用于GSH和PRO。 D001大孔樹(shù)脂離子交換柱的試驗(yàn)流程GSH的抽提液調(diào)pH →上樣→測(cè)量流出量，計(jì)算吸附率、吸附量→洗液洗滌柱子→測(cè)量漏液量，計(jì)算損失率→洗脫→測(cè)量洗脫量，計(jì)算洗脫率→洗脫液濃縮備用。并研究上柱和洗脫的工藝參數(shù)。 D001大孔樹(shù)脂分離GSH的研究(1) D001大孔樹(shù)脂的預(yù)處理：取一定量的D001大孔樹(shù)脂，用自來(lái)水反復(fù)洗滌去除 雜質(zhì)，用2mol/L的NaOH溶液浸泡洗滌(流速：)，用去離子水洗至中性，再用2mol/L HCL溶液洗滌(流速：)，再用去離子水洗至中性，最后浸泡于去離子水備用。(2) 大孔樹(shù)脂的再生方法：用2倍體積2%～4% NaOH 溶液浸泡樹(shù)脂4h，再采用2 mol/L的HCl浸泡、攪拌2h 以上，用去離子水清洗至中性。 GSH上樣pH的選擇試驗(yàn)(1) 準(zhǔn)備6支小層析柱，編號(hào)為xxxxxx6 。(2) 將處理好的D001樹(shù)脂依次裝入上述6支柱中。(3) 、、。(4) DTNB法分別測(cè)量各柱流出液GSH含量，計(jì)算吸附率。 GSH上樣濃度的選擇試驗(yàn)(1) 準(zhǔn)備3支小層析柱，編號(hào)為xxx9 。(2) 將處理好的D001樹(shù)脂依次裝入上述3支柱中。(3) 將GSH上樣液濃度分別為初始濃度、稀釋10倍、稀釋50倍濃度的上樣液調(diào)最佳pH值后，上柱。(4) DTNB法分別測(cè)量各柱流出液GSH含量，計(jì)算吸附率。 GSH上樣流速的選擇試驗(yàn)(1) 準(zhǔn)備4支小層析柱，編號(hào)為xx1x1x13 。(2) 將處理好的D001樹(shù)脂依次裝入上述4支柱中。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣后，、。(4) DTNB法分別測(cè)量各柱流出液GSH含量，計(jì)算吸附率。(1) 準(zhǔn)備4支小層析柱，編號(hào)為x1x1x1x17。(2) 將處理好的D001樹(shù)脂依次裝入上述4支柱中。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣，調(diào)整最佳流速上樣完畢后，分別用去離子水、無(wú)水乙醇、15%乙醇、95%乙醇洗滌柱子雜質(zhì)。(4) DTNB法分別測(cè)量各柱流出液GSH含量，計(jì)算損失率。(1) 準(zhǔn)備5支小層析柱，編號(hào)為x1x1xx2x22。(2) 將處理好的D001樹(shù)脂依次裝入上述5支柱中。(3) 上樣與洗滌完畢后，分別用pH=、%NaCl、1mol/LNaOH、% HCl + 。(4) DTNB法分別測(cè)量各柱流出液GSH含量，計(jì)算洗脫率。(1) 準(zhǔn)備5支小層析柱，編號(hào)為x2x2x2x2x2(2) 將處理好的D001樹(shù)脂依次裝入上述5支柱中。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣后，、。 D001大孔樹(shù)脂分離GSH重復(fù)放大試驗(yàn)(1) 50cm玻璃層析柱1支，編號(hào)A柱。將處理好的D001樹(shù)脂裝入柱中，柱床高度為50cm。(2) 、pH=3上樣60mL，用無(wú)水乙醇洗滌雜質(zhì)，+，流速為3mL/min, DTNB法檢測(cè)洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)PRO含量。計(jì)算GSH吸附率、損失率、洗脫率，回收率、PRO去除率等結(jié)果。(3) 重復(fù)三次試驗(yàn)，計(jì)算得出結(jié)果平均值。 SephadexG10凝膠柱的試驗(yàn)流程離子交換A柱的濃縮液上樣B柱脫鹽柱→洗脫液洗脫→測(cè)量洗脫量→B柱脫鹽柱的濃縮液上樣C柱分級(jí)分離柱→洗脫液洗脫→測(cè)量洗脫量→計(jì)算去蛋白率、濃縮倍數(shù)、純化倍數(shù)。并研究上柱和洗脫的工藝參數(shù)。 SephadexG10純化GSH的研究 SephadexG10的預(yù)處理凝膠溶脹：將SephadexG10干粉室溫用10倍體積的蒸餾水充分溶脹24小時(shí)，再用沸水浴煮沸2h,攪拌后繼續(xù)用傾瀉法將不容易沉下的較細(xì)顆粒除去，直至上清液澄清為止。 SephadexG10（脫鹽）GSH上樣濃度的選擇試驗(yàn)(1) 25cm玻璃層析柱2支，編號(hào)BB2柱。將處理好的D001樹(shù)脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) 將B柱洗脫濃縮液分別按初始濃度、稀釋10倍濃度依次上樣BB2柱。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量。 GSH上樣體積的選擇試驗(yàn)(1) 25cm玻璃層析柱5支，編號(hào)BBBBB7柱。將處理好的D001樹(shù)脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) 將B柱洗脫濃縮液按最佳濃度，分別上樣10mL、20mL、30mL、40mL、50mL。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量。 SephadexG10（脫鹽）重復(fù)試驗(yàn)(1) 25cm玻璃層析柱1支，編號(hào)B8柱。將處理好的SephadexG10裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) ,上樣體積為20mL。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量，得實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。 SephadexG10（分級(jí)分離）GSH上樣體積的選擇試驗(yàn)(1) 25cm玻璃層析柱3支，編號(hào)CCC3柱。將處理好的SephadexG10裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) 、分別上樣2mL、5mL、10mL。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量。 SephadexG10（分級(jí)分離）重復(fù)試驗(yàn)(1) 25cm玻璃層析柱1支，編號(hào)C4柱。將處理好的D001樹(shù)脂裝入柱中，柱床高度為25cm。(2) ，上樣體積為2mL。(3) DTNB法分別測(cè)量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測(cè)洗脫液中PRO含量，得實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。 D001大孔樹(shù)脂分離GSH的研究結(jié)果 GSH上樣pH的選擇試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)pH3時(shí)，吸附容量隨著pH值的升高而增加，在pH=3時(shí)吸附容量達(dá)到最大值，之后隨著pH值的升高而減小。這表明，料液pH值是決定離子交換平衡關(guān)系的一個(gè)重要因素，GSH在pH1～3范圍內(nèi)大部分以正電荷存在，所以很容易與H型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂發(fā)生交換行為。這是由于pH=3時(shí)，溶液中主要存在GSH正離子，其選擇性系數(shù)較高，與樹(shù)脂之間的交換屬優(yōu)惠平衡；但是當(dāng)pH為2時(shí)，柱的交換容量相對(duì)有些下降。其原因是由于溶液中氫離子的濃度增加，與GSH正離子形成競(jìng)爭(zhēng)吸附，導(dǎo)致GSH正離子選擇吸附性下降，從而使交換容量下降。 GSH上樣濃度的選擇試驗(yàn)結(jié)果，不同濃度的上柱料液對(duì)大孔樹(shù)脂吸附GSH的影響不大，但是采用較小濃度的料液達(dá)到飽和交換容量的時(shí)間會(huì)較長(zhǎng)，這樣成本會(huì)增加，從工業(yè)化角度講是不可取的。而且上樣液濃度為614mg