【正文】 添加時(shí)間20h。本文以富含GSH的啤酒酵母Y14為材料，分別從以下四個(gè)方面進(jìn)行研究：(1) 利用PlackettBurman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到的最適培養(yǎng)基配方為: 葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 。X X X X 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文發(fā)酵工程碩士論文題 目： 谷胱甘肽發(fā)酵條件的優(yōu)化擴(kuò)大及其分離純化 英文題目： The Optimization and Amplification of FermentationConditions of Glutathione and its Separation and Purification申請學(xué)位學(xué)科專業(yè)：發(fā)酵工程摘 要谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，具有清除自由基、解毒、抑制衰老、預(yù)防糖尿病和癌癥、抑制艾滋病毒、提高人體免疫力等重要生理功能，在醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的市場前景?，F(xiàn)有GSH生產(chǎn)能力遠(yuǎn)不能滿足市場需求，所以采用GSH高產(chǎn)菌株發(fā)酵廉價(jià)原料轉(zhuǎn)化為GSH，建立適合工業(yè)化分離純化GSH的方法會(huì)帶來巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此條件下，較原來提高了102%。②采用恒速流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基，36h時(shí)添加補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法。(4) 采用D001大孔樹脂粗分離GSH，得到最佳分離條件為：，洗雜質(zhì)用液為無水乙醇，% HCl + ，流速為3mL/min。然后通過SephadexG10脫鹽純化GSH，得到最適條件：25cm玻璃層析柱，上樣體積為20mL。最后SephadexG10分級分離純化GSH，50cm玻璃層析柱，最適上樣體積為2mL，%，%。這種神奇的物質(zhì)，科學(xué)上稱之為谷胱甘肽(GSH)。近日，據(jù)有關(guān)病毒學(xué)家介紹：每天補(bǔ)充50毫克GSH，可快速產(chǎn)生還原性免疫細(xì)胞，增強(qiáng)人體免疫力。美國著名的醫(yī)學(xué)專家古特曼博士這樣預(yù)測：“谷胱甘肽很快就會(huì)像膽固醇一樣，成為人們衡量健康指標(biāo)之一。其化學(xué)名為γL谷氨酰半胱氨酸甘氨酸[3](英文名：γLglutamylcysteinylglycine，簡寫為GSH)，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示： GSH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖 Chemical structural of glutathione1888年P(guān)ailbode首先發(fā)現(xiàn)GSH，1921年Hopkins[4]從酵母抽提物和動(dòng)物肝臟中首先分離得到GSH結(jié)晶并命名，1929年Hopkins、Kendall等提出GSH為三肽并初步提出它的結(jié)構(gòu)，1935年由Harington和Mead闡明其化學(xué)結(jié)構(gòu)并加以化學(xué)合成[5]，隨后在1936年被Du Vigneaud和Miller驗(yàn)證[6]，1938年利用酵母制備GSH的最早專利發(fā)表。如圖12所示[7]： GSH細(xì)胞內(nèi)合成途徑 Intracellular synthesis pathways of GSH，熔點(diǎn)189～193℃，晶體呈無色透明細(xì)長柱狀。(C=，H2O)，它易溶于水、稀醇、液氨和N,N39。GSH在高水分活性下不易保存。通常人們所指的谷胱甘肽是還原型谷胱甘肽，GSH固體較為穩(wěn)定，但其水溶液在空氣中極易被氧化成GSSH。它可以由谷胱甘肽還原酶利用NADPH作為電子供體還原成GSH，[9]:GSSH + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ GSH與GSSG之間的相互轉(zhuǎn)換方程式 The interconversion formula of GSH and GSSG 酵母細(xì)胞中氧化型和還原型谷胱甘肽之間的相互轉(zhuǎn)化過程，： GSH與GSSG之間的相互轉(zhuǎn)換過程圖 The interconversion process of GSH and GSSG 谷胱甘肽的生理功能及其應(yīng)用單態(tài)氧、超氧化物陰離子、羥基離子、過氧化氫等物質(zhì)統(tǒng)稱為活性氧簇，(Reactive oxygen species 簡稱為ROS)[10]，即自由基。GSH可作為抗氧化劑通過氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)清除自由基[11]，被稱為長壽因子和抗衰老因子。GSH這個(gè)積極的多肽化合物擁有著多功能的特性，被稱為最重要的可自我產(chǎn)生的防衛(wèi)分子[12]，主要表現(xiàn)在三個(gè)方面：抗氧化劑[13]、提高免疫力[14]、高等真核生物有機(jī)體的解毒劑[15]等。GSH強(qiáng)大的還原作用使肝細(xì)胞膜對氧自由基的耐受性增加，從而使GSH具有促進(jìn)肝功能，保護(hù)肝細(xì)胞膜，提高肝臟酶的活性，加快黃疸的消退，增強(qiáng)肝臟解毒等功能，可用于輔助治療重型病毒性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝，對藥物性腎和肝損害也有保護(hù)作用[17]。GSH能激活多種酶(如巰基SH酶)，從而促進(jìn)糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝，并影響細(xì)胞的代謝過程，同時(shí)通過巰基與體內(nèi)自由基結(jié)合，可以轉(zhuǎn)化成容易代謝的酸類物質(zhì)，從而加速了放化療產(chǎn)生的自由基的排泄。GSH能與進(jìn)入機(jī)體的有毒化合物(如：丙烯腈、氟化物、CO)、重金屬離子等直接結(jié)合，并促其排出體外，起到中和解毒的作用[19]。(5) 治療眼科疾病，特別是應(yīng)用于白內(nèi)障的治療[21]。(6) 其他功能。因此GSH正代表著一個(gè)巨大的潛在價(jià)值在臨床治療戰(zhàn)略中發(fā)揮舉足輕重的作用[24]。GSH的生產(chǎn)方法主要有萃取法、化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法。利用特定微生物的代謝將廉價(jià)原料轉(zhuǎn)化為GSH的方法。自1938年實(shí)現(xiàn)了由酵母制備GSH以來，發(fā)酵法生產(chǎn)GSH 的工藝及方法不斷得到改進(jìn)，且發(fā)酵使用的細(xì)菌或酵母容易培養(yǎng)，原料容易獲得，條件容易控制，因此發(fā)酵法已成為目前生產(chǎn)GSH最普遍的方法。世界主要的氨基酸制造商Kyowa、Ajinomoto和Deguss等都相繼投巨資于氨基酸的研究與開發(fā)，而GSH是其重點(diǎn)之一，Kyowa目前是GSH主要的供應(yīng)商(中國發(fā)酵網(wǎng)）。下面著重對發(fā)酵法生產(chǎn)GSH 的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)：富含GSH菌種的選育、發(fā)酵過程的優(yōu)化與放大及GSH的分離提取工藝等詳述。 Kimura等[25]采用亞硝基胍和紫外線誘變大腸桿菌B355，獲得高產(chǎn)GSH 的優(yōu)良突變株。 陜西省微生物研究所詹谷宇等[27]在酵母菌的誘變育種中用GSH的代謝類似物乙硫氨酸作為抗性篩選物，篩得抗代謝類似物突變株KllUE 126，%，這是我國目前通過常規(guī)誘變方法獲得的GSH含量最高的菌株。這是目前國外文獻(xiàn)報(bào)道中GSH含量最高的。通過在線監(jiān)測發(fā)酵液中溶氧和乙醇的濃度，運(yùn)用前饋/反饋控制系統(tǒng)控制葡萄糖的流加速率，GSH產(chǎn)量達(dá)到2360mg/L，細(xì)胞內(nèi)GSH含量達(dá)到37mg/g，這是所查文獻(xiàn)報(bào)道中GSH產(chǎn)量最高的。衛(wèi)功元，李寅等[31]針對假絲酵母的生長特征以及GSH生物合成的要求，選擇葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉等物質(zhì)進(jìn)行考察，結(jié)果顯示C. utilis WSH 02～08基本上不能利用乙酸和可溶性淀粉，葡萄糖更有利于促進(jìn)GSH的合成，且可以將胞內(nèi)GSH含量一直保持在較高水平。GSH的產(chǎn)量和含量在葡萄糖初始濃度為30g/L時(shí)達(dá)到最高。經(jīng)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化后， mg/L。江南大學(xué)陳堅(jiān)等[34]考察了葡萄糖濃度對面包酵母(Saccharomyces cerevisiae) WSHJ發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響，結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖起始濃度超過12g/L時(shí)，胞內(nèi)GSH含量減少，葡萄糖總濃度為30g/L的發(fā)酵液中，而葡萄糖總濃度為10g/L時(shí)。氮源氮源是構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中的氮素的營養(yǎng)物質(zhì)。時(shí)麗萍，郭學(xué)武等[32]分別考察了有機(jī)和無機(jī)氮源對酵母積累GSH的影響，結(jié)果顯示，酵母粉為最合適的有機(jī)氮源，可能是因?yàn)榻湍阜壑泻卸喾N生長因子和氨基酸，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和GSH的合成。當(dāng)酵母粉的濃度超過9g/L時(shí)，對GSH的積累產(chǎn)生了一定的抑制作用。硫酸銨為最適的無機(jī)氮源，硫酸銨濃度為9g/L時(shí)，GSH 的產(chǎn)量和含量明顯高于其他濃度，故此濃度為最適濃度。江南大學(xué)陳堅(jiān)等[34]考察了氨基酸和酵母膏的添加對面包酵母() WSHJ發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加L半胱氨酸、蛋氨酸能提高細(xì)胞內(nèi)GSH的含量；L半胱氨酸的效果更顯著，但對細(xì)胞生長有一定的抑制作用；添加由L半胱氨酸、谷氨酸與甘氨酸組成的混合物也能提高細(xì)胞胞內(nèi)GSH的含量。Alfafara[36]等研究了半胱氨酸的補(bǔ)加策略，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)流加后期，細(xì)胞比生長速率和GSH比生產(chǎn)速率皆下降，整個(gè)發(fā)酵過程中GSH含量與不加半胱氨酸相比，無顯著提高；而一次性補(bǔ)加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生產(chǎn)速率。② 培養(yǎng)條件時(shí)麗萍，郭學(xué)武等[38]對面包酵母BY14產(chǎn)GSH的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，其最適的培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵時(shí)間22h，溫度28℃，接種量10%，裝液量50mL。衛(wèi)功元，李寅等[39]在7 L發(fā)酵罐中研究了溶氧和pH對產(chǎn)朊假絲酵母分批發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響。不同pH控制方式對GSH分批發(fā)酵的影響有較大差異。同時(shí)研究了24～32℃范圍內(nèi)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)GSH的分批發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)較高溫度(30℃)對細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，而較低溫度(26℃)則更有利于GSH產(chǎn)量的提高。③ 培養(yǎng)方式衛(wèi)功元，李寅等[40]考察了重復(fù)補(bǔ)料、恒速流加和指數(shù)流加等不同培養(yǎng)方式對產(chǎn)朊假絲酵母中GSH發(fā)酵生產(chǎn)的影響。綜合比較，無論是從細(xì)胞還是從GSH的產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度的角度來看，指數(shù)流加都是較為理想的選擇。三、GSH的分離純化工藝GSH的粗提物進(jìn)一步分離純化的方法主要有4種：(1) 銅鹽法，具有使用價(jià)值，但污染較大。蔡俊，邱雁臨[42]對使用732陽離子交換樹脂法提取GSH時(shí)的提取條件進(jìn)行了研究，洗脫流速30cm/min， %，%。邱雁臨，胡靜等[43]對大孔樹脂D001分離啤酒廢酵母中的GSH進(jìn)行了研究。在最佳分離條件下，%，%，產(chǎn)品顏色為白色。自制的含硫樹脂最大吸附容量可達(dá)22mg/g濕樹脂。采用真實(shí)發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，收率為35%。%HCl溶液進(jìn)行洗脫，%，蛋白質(zhì)去除率60%，()，獲得了良好的分離效果。(4) 雙水相分配結(jié)合溫度誘導(dǎo)相分離可以省去細(xì)胞破碎后的固液分離操作，并且利用溫度誘導(dǎo)相分離能實(shí)現(xiàn)聚合物的循環(huán)利用。 本研究的意義、目的及內(nèi)容 意義GSH具有清除自由基、維持DNA生物合成、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收、維持細(xì)胞正常生長、維持紅細(xì)胞的完整性、細(xì)胞免疫等生理功能。在化妝品領(lǐng)域中，它有抗衰老、增白、祛斑等作用。日本早在1985年就取得了中國衛(wèi)生部的原料藥進(jìn)口許可證號，基本壟斷中國市場。實(shí)現(xiàn)GSH的國產(chǎn)化，不僅可以改變我國GSH原料藥依賴進(jìn)口的局面，而且對我國醫(yī)藥工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)均具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。 研究內(nèi)容利用PlackettBurman設(shè)計(jì)和BoxBehnken設(shè)計(jì)對富含GSH啤酒酵母Y14搖瓶發(fā)酵GSH工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用SAS軟件進(jìn)行回歸分析確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成成分。將上述最佳試驗(yàn)條件運(yùn)用到10L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)GSH的擴(kuò)大重復(fù)試驗(yàn)當(dāng)中，以確定最有利于工業(yè)生產(chǎn)的試驗(yàn)方案。后采用Sephadex G10凝膠雙柱精制GSH，研究最適的脫鹽上樣體積與濃度，分級分離上樣體積，達(dá)到較理想的GSH純化效果。菌體胞內(nèi)GSH的含量：表示每克干菌體胞內(nèi)GSH的含量，簡稱GSH含量，單位為mg/g；GSH的產(chǎn)量：表示每升發(fā)酵液中總干菌體胞內(nèi)GSH的含量，簡稱GSH產(chǎn)量，單位為mg/L；生物量：表示每升發(fā)酵液中菌體烘干后的重量，單位為g/L。在實(shí)際的發(fā)酵生產(chǎn)中，選育性能優(yōu)良的菌種僅僅是一個(gè)開始，還需要對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化控制，最大限度地發(fā)揮其生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的能力。一些試驗(yàn)設(shè)計(jì)(如正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、因次分析設(shè)計(jì)、中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)等)及數(shù)據(jù)處理方法(如PlackettBurman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型)的應(yīng)用可以減少工作量并且使試驗(yàn)結(jié)果具有更高的可信度和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。李寅[48]等采用正交試驗(yàn)獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡(luò)模型(Neural Network Model)進(jìn)行分析預(yù)測， WSH 02～08發(fā)酵生產(chǎn)GSH的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，%，GSH產(chǎn)量和細(xì)胞干重也有大幅度的提高。 材料 菌種：啤酒酵母Y14，由XXXX大學(xué)工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室再生資源微生物轉(zhuǎn)化研究室提供。 種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5。 主要試劑葡萄糖AR廣州化學(xué)試劑廠蛋白胨BR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司牛肉浸膏BR上海長陽生化制藥廠(NH4)2SO4AR北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司MgSO4 種子搖瓶培養(yǎng) 用接種環(huán)取一滿環(huán)已活化的菌種于種子培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖瓶裝量50mL/250mL條件下培養(yǎng)18h。 菌種的保藏菌種接于斜面培養(yǎng)基上4℃冰箱保藏。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法1) PlackettBurman 設(shè)計(jì)[50] 對影響GSH生產(chǎn)的14個(gè)營養(yǎng)因素進(jìn)行考察,每個(gè)因素取2個(gè)水平，各因素及其水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，表2中每行代表1個(gè)試驗(yàn)，每列代表1個(gè)獨(dú)立的變量，符號“ + ”和“”分別代表高和低2個(gè)不同的水平。每個(gè)因素取3個(gè)水平，在中心點(diǎn)上有3個(gè)重復(fù)。3) 對優(yōu)化試驗(yàn)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行擬合，便可以得到模型中的各個(gè)系數(shù)。最后按照計(jì)算所得到的參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證模型的可靠性，確定最后的優(yōu)化結(jié)果。 結(jié)果與分析 顯著影響因素的篩選結(jié)果根據(jù)啤酒酵母生長所需營養(yǎng)要素并結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，試驗(yàn)選取的影響因素(變量)共14個(gè)，AN編碼了14個(gè)因素，標(biāo)號為116，每行代表1個(gè)試驗(yàn)，按照設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，每組重復(fù)3次。 PlackettBurman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)的的回歸系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Tab Regression coefficients and their significance test of Pl