生物技術(shù)課件——02基因工程常用工具酶(參考版)
2025-01-11 02:09本頁面
【正文】 。 ? 1981 Cech和 Altman首次發(fā)現(xiàn)，并因此獲得1989年的諾貝爾獎。 ? 具有酶活性的 RNA片段 。 （ 3）在 DNA部分變性條件下，能在富含 AT區(qū)切斷DNA。 ? S1 核酸酶 （ 1）降解 單鏈核酸。 PNKase PMase 5′HO A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C OH 5′ 多核苷酸激酶 磷酸酶 5′p A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C p 5′ ? Bal31 核酸酶 （ 1）從 DNA末端同時降解兩條鏈。 ? 末端標記 ? 磷酸酶：催化核酸分子脫掉 5’ 磷酸基團，將 5’ － P末端轉(zhuǎn)化為 5’ － OH。當反應(yīng)混合物中只有一種 dNTP時，可以形成 同聚物尾 。 ? 用途： ? （ 1）逆轉(zhuǎn)錄； ? （ 2）對 RNA:DNA雜交體中的 RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用 NaOH降解 RNA模板的步驟。 ? 測序， 高溫 下進行 DNA合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。 ? 活性：聚合最適溫度為 7580℃ ，不具 3′→5′ 外切酶活性，具 5′→3′ 外切活性 。 ? 在 cDNA 克隆中，合成 cDNA第二條鏈 ? 應(yīng)用 Sanger雙脫氧法進行 DNA測序。 ? 分子雜交：探針 DNA或 RNA與被測物的互補結(jié)合叫做分子雜交（ molecular hybridization） ? 來源： DNA PolymeraseⅠ 經(jīng)蛋白酶水解的大片段 (Klenow和 DNApolⅠ 枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶 C 端 (76kd) + N 端（ 36kd） Klenow 5’ → 3’ 聚合 3’ → 5’ 外切 5’ → 3’ 外切 ? 用途 ? 填補限制酶的 5′ 粘性末端為平齊末端 ? 3′ 末端標記 Klenow 在無底物時只進行 3′ → 5′ 外切；有底物存在時則聚合 。 5‘ 3’ 5‘ ↓ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 5‘ ↓ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 外切酶活性 5‘ 3’ 聚合酶活性 5‘ 3’ 5‘ ↓ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 5‘ ↓ 3’ 3‘ 5’ 未經(jīng)標記的核苷酸 經(jīng)標記的核苷酸 5‘ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 3‘ 5’ * * * * * * * * (a) (b) (c) (d) (e) (a)雙鏈的 DNA分子 (b)帶有 3’OH末端的單鏈缺口 (c) polⅠ 從 5‘P移去一個核苷酸 (d) polⅠ 將 32P標記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸 (e)重復 (c)(d)的步驟，缺口沿5’3‘方向移動，形成 32P標記的核苷酸合成的 DNA鏈
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