藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證(參考版)
2025-01-09 08:03本頁面
【正文】 CHPLC衍生化可分為柱前衍生法與柱后衍生法兩種 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 柱后衍生法 —— 是在色譜分離 (出柱 )后 ， 色譜流出組分直接在系統(tǒng)中與衍生試劑及輔助反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng) ， 在線檢測衍生化產(chǎn)物 。 最常用的酶 — 蛋白水解酶中的 枯草菌溶素 可在較寬的 pH范圍 (~)內(nèi)使蛋白的肽鍵降解， 在 50~60℃ 具有最大活力 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 （２）綴合物的水解（自學(xué) ） 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 （ 3）分離、純化與濃集 目的： a—消除內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物及其他共存 物質(zhì)的干擾； b—提取濃縮待測物質(zhì)，使其易于檢測 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 —— 液 — 液萃取法 (傳統(tǒng)的方法 ) —— 固相萃取法 (液 — 固萃取法 ) —— 自動化固相萃取技術(shù) —— 固相微萃取 —— 膜萃取技術(shù) —— 微透析技術(shù) —— 超臨界流體萃取法 方法： （ 3）分離、純化與濃集 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 A：溶劑的選擇 ——試驗(yàn)成功的 主要條件 ——相似相溶的原則 ——對藥物的未電離分子可溶 、 電離形式分子不溶 ——沸點(diǎn)低 、 易揮散 ， 毒性小 ——與水不相混溶 ——具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性 ① 液 —液萃取法 (liquidliquid extraction, LLE) 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 萃取次數(shù) ——通常為 1次 (萃取 R在 70%以上 ) ——必要時 2~3次 (萃取 R在 50%以下 ) 每次 用量 ——和水相的體積比通常為 1:1或 2~5:1 萃取方式 ——分液漏斗或渦流混合 B：萃取方法 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 C：水相 pH值 水相 pH值 ——藥物的 pKa確定 ——90%以上的非電離形式 堿性藥物最佳 pH值： 高于 pKa值 1~2個 pH單位 酸性藥物最佳 pH值 ： 低于 pKa值 1~2個 pH單位 一般規(guī)則： 堿性藥物在堿性 pH值、酸性藥物在酸性 pH值 介質(zhì)中提取； 生物樣品宜在堿性或近中性提取 —— 生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易萃取 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 pH = 13 pH = 7 pH = 2 空白血清乙醚提取物的 HPLC色譜圖 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 2. 固相萃取法 （ Solidphase extraction, SPE） ① SPE原理 —— 將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當(dāng)溶劑清洗雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。 —— 保存時間為 24~36h(4℃ )或長期 (20℃ ) 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 （四）生物樣品分析的前處理技術(shù) 1. 生物樣品分析前處理的目的 在測定體內(nèi)藥物及其代謝物時，首先需對復(fù)雜的生物樣品實(shí)施 分離、凈化、濃集、化學(xué)衍生化 等樣品預(yù)處理過程 ——為藥物的最終測定創(chuàng)造良好條件，具體表現(xiàn)在四個方面： 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 (1) 使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放 ——測定藥物的總濃度 (2) 使樣品純化 ——消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 (3) 提高檢測靈敏度 ——適應(yīng)和符合測定方法要求的靈敏度 (4)防止分析儀器的污染和劣化 ——提高分析儀器的耐受程 度 、 改善分析結(jié)果 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 1. 生物樣品分析前處理的目的 生物樣品的預(yù)處理大致分為以下五類 （ 1） 去除蛋白質(zhì) （ 2） 綴合物的水解 （ 3） 分離 、 純化與濃集 （ 4） 化學(xué)衍生化 （ 5） 有機(jī)破壞法 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 （ 1）去除蛋白質(zhì) 目的： 結(jié)合型藥物釋放 、 減少乳化的產(chǎn)生 、 保護(hù)儀器 常用方法： ① 加入與水混溶的有機(jī)溶劑 ——蛋白質(zhì)脫水沉淀 ② 加入中性鹽 ——“鹽析”沉淀蛋白質(zhì) ③ 加入強(qiáng)酸 ——與蛋白質(zhì)陽離子 (銨基 )形成不溶性鹽沉淀 ④ 加入重金屬鹽 ——與蛋白質(zhì)陰離子 (羧基 )形成鹽沉淀 ⑤ 酶水解法 ——蛋白分解酶分解蛋白質(zhì) 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 ① 加入與水相混溶的有機(jī)溶劑 常用的有機(jī)溶劑 —— 乙腈 、 甲醇 、 乙醇 、 丙醇 、 丙酮 、 四氫呋喃等 血樣與溶劑的體積比 —— 1∶( 13)—— 除去 90% 以上蛋白質(zhì) 離心分離 —— 高速 (10000r/min)離心 1~2min 上清液 pH ——~ 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 ② 加入中性鹽 常用中性鹽 —— 飽和 (NH4)2SO Na2SO Mg2+、 PO43及枸櫞酸鹽等 試劑用量 —— 血樣與飽和 (NH4)2SO4的比例為 1∶ 2時 —— 除去 90%以上的蛋白質(zhì) 離心分離 —— 高速 (10000r/min)離心 1~2min 上清液 pH —— ~ 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要求 ③ 加入強(qiáng)酸 常用的強(qiáng)酸 —— 10%三氯醋酸 、 6%高氯酸 、 5%偏磷酸等 試劑用量 —— 血清與強(qiáng)酸的比例為 1∶ —— 除去 90%以上的蛋白質(zhì) 離心分離 —— 高速 (10000r/min)離心 1~2min 上清液 pH —— pH 0~4 第三節(jié) 生物樣品分析 方法的基本要
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