ecoli感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定(參考版)
2025-01-08 02:56本頁(yè)面
【正文】 根據(jù) DNA限制酶的識(shí)別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為幾種類(lèi)型？其中 II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶有何特性？ 在用堿裂解法小量制備質(zhì)粒過(guò)程中 I液、 II液與III液的作用機(jī)理是什么？ 簡(jiǎn)述堿裂解法小量制備質(zhì)粒的原理。 五 . 實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告： 轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算 ： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積 /涂板菌液體積） 轉(zhuǎn)化效率 （ 每微克質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù) ） ＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)（個(gè)轉(zhuǎn)化子） /加入質(zhì)粒 DNA的量（ μg） 質(zhì)粒提取與酶切鑒定結(jié)果，貼上打印實(shí)驗(yàn)照片并標(biāo)明照片上各 DNA條帶的含義。 在紫外燈 (310nm波長(zhǎng) )下觀察染色后的凝膠。 制好膠后將凝膠連同內(nèi)槽放在含有 TBE或 1 TAE緩沖液的電泳槽中使用 (注意 :電泳槽中的緩沖液應(yīng)與配膠用的緩沖液成分、濃度一致 )。 酶解完成后，加入 ?l 10 上樣緩沖液 (或 2 ?l 6 上樣緩沖液 ), 混勻 . 稱(chēng)取 1g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入 100mL TBE或 1 TAE緩沖液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。 溶液 II中的 NaOH與 SDS可裂解細(xì)胞，使 DNA變 性以及 SDS使蛋白變性并形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 加入 150?l溶液 III, 加蓋后顛倒 67次混勻，冰上放置 2～ 3min； 溶液 III為低 pH的醋酸鉀緩沖液，中和 NaOH，以便使部 分變性的閉環(huán)質(zhì)粒復(fù)性，而細(xì)菌染色體 DNA不能正確復(fù)性 12022 g離心 6 min，將上清移入另一干凈的 Ep管中； 加 2倍上清體積 (約 1mL)的無(wú)水乙醇 , 振蕩混勻，室溫放置 2min. 12022g離心 10min，棄上清液，再用 70％的乙醇洗滌一次， 12022g離心 1min，離心管倒置于吸水紙上扣干，然后在中空濃縮系統(tǒng)上干燥質(zhì)粒； 加入 40?L含 20 ?g/mL RNase A的滅菌蒸餾水或TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置直到質(zhì)粒完全溶解 (約8min)，存于－ 20℃ 或直接用于酶切 。L接種于含抗菌素的 LB平板培養(yǎng)基上，用玻璃涂棒涂勻； 將培養(yǎng)皿放在 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 30 min,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜 (1416h) ； （三）堿裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA: 挑取轉(zhuǎn)化篩選的帶有目的質(zhì)粒的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中， 37℃ 震蕩培養(yǎng) 12～ 16小時(shí)； 將 Ep離心管中， 12022 g離心30 Sec，棄上清液，在吸水紙上扣干； 離心時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免影響下一步的菌體懸浮 加入 100?L預(yù)冷的溶液 I ，于渦旋振蕩器上振蕩懸浮細(xì)菌細(xì)胞，盡量使細(xì)胞分散； 溶液 I中的葡萄糖的作用是增大讓一讓的粘度，減少提取 過(guò)程
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