【正文】 一些實(shí)驗(yàn)也建議補(bǔ)充同等體積的 40%甘油和半體積的 M NaCl Send ments and updates to Dr. Bart Frank, Arthritis and Immunology Program, OMRF 蛋白電泳凝膠考馬斯亮藍(lán)染色 1. 經(jīng)蛋白電泳凝膠 ,凝膠轉(zhuǎn)移至染色圓托盤 . 放入 ~200毫升蛋白質(zhì)凝膠染色試劑 . 2. 微波 ~45秒 ,直到溶液剛開始煮沸 . 在常溫輕輕震蕩孵育 1015分鐘 . 加熱使凝膠染色速度 . 另外 ,泡膠著色為 1小時(shí)室溫 . 3. 把染液收回瓶以后再用 . 用水漂洗凝膠 . 放入 ~200 毫升蛋白質(zhì)凝膠脫色試劑 . 微波 ~45 秒 ,直到溶液剛開始煮沸 . 在常溫 15分鐘。 1 mM EDTA) 600毫升溶液 : g Tris ml ， EDTA pH用約 7滴濃鹽酸調(diào)至 ，用巴斯德吸管 (穿酸橡皮手套 )或 4 ml ， 1 M HCl. 600 毫升 QS 用水和高壓器 . RNAse (10 mg/ml) RNAse 在水中溶解，煮沸五分鐘 . 貯存在 20176。l 5 M NaCl 400 181。g/ml .蛋白酶 K). ml H2O 40 181。 C 透析瞬間煮沸的透析管溶液：冰凍的 20mMTrisHCl,10mM 氯化鈉、 EDTA. 透析液 2升透析 3X. 260nm 和 280nm 處測(cè)定 DNA. 一個(gè)典型 的產(chǎn)量從 1克肝或 108細(xì)胞是 510 毫克，在 260nm和 280nm 處 分離外周血白細(xì)胞 : 改裝 wyman 白色芯片 77:67546758(1980) 1050ml 外周血抗凝、 EDTA 是首選 . 用離心機(jī) 300xg(1200 年貝克曼的 RPM和 TJ6 離心機(jī) )室溫下離心顆粒細(xì)胞 10分鐘 . 清除及凍結(jié)血漿 (如有需要 ). 黃色細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管中 . 在 PBS中混懸其余黃色細(xì)胞層和紅細(xì)胞 ,用 %的 EDTA(1:186 稀釋， EDTA )和 respin. 加上 初步收集黃色 細(xì)胞層 ,旋轉(zhuǎn)一次或兩次降低紅細(xì)胞并轉(zhuǎn)移白細(xì)胞到一個(gè)新的管中 . 最后含有大約等量白血細(xì)胞數(shù)量和紅血球是較好的 . 3 個(gè)小時(shí) ,同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn) 1020ml 在預(yù)先加熱 55℃溶解溶液 (1mM EDTA,10 mM TrisHCl,pH ,10 mM 氯化鈉 ,1%SDS 和 100微克 /毫升蛋白酶鉀 ). 34倍苯酚 /氯仿溶液 ,每次丟棄下層 . 乙醚或氯仿提取 . 不應(yīng)看到的 提取后溶液有血紅蛋白 . .在 12ml混懸液中 ,處理 RNAse 20ul/ml, 1 小時(shí) ,37℃ . 3 倍酚提取 . 乙醇沉淀、 混懸液 . 一個(gè)典型的 DNA 產(chǎn)量為 200400181。 的原始體積 . 3次 . .吹入 N2 氣體 第 2天 DNA 溶液加到 10毫米氯化鈉 . 到 100毫克 /毫升 ,在 37176。 189。Blin 法修改核質(zhì) . 酸 . 3:2303,1976) 預(yù)先準(zhǔn)備 : 飽和苯酚 ,55℃水浴 ,和 55℃ 20 毫米的 TrisHCl,pH 值 。 pH 2% SDS 10% Glycerol 1% bMercaptoethanol mM EDTA % Bromophenol Blue To make a 4X Stock (10 ml) ml 1M TrisHCl。d to with HCl 10% SDS (or g solid) ~350 ml ddH2O Buffer 25 mM Tris。 pH % SDS ml To make a 4X Stock (500ml) g Tris base。 pH39。 C處理 30 min ,然后加入凝膠 這不是樣品加載之前運(yùn)行的 .蛋白質(zhì)凝膠電泳要比核酸凝膠慢 ,因此可能需要更長(zhǎng)的電泳時(shí)間 .電泳的條件是 :20CM 凝膠，電泳 3~4小時(shí) ,當(dāng)然電泳所需的時(shí)間取決于樣品性質(zhì) .電泳的功率約為 23 watts,電泳約 30 minutes ,之后功率 增加到 810 做法是 ,使用 markers 對(duì)泳動(dòng)樣品 進(jìn)行標(biāo)記 ,這樣可以達(dá)到兩個(gè)目的 : (1)監(jiān)控電泳過程 ,指示任何運(yùn)行凝膠 .(2)提供分子量標(biāo)記 ,以便于讓你標(biāo)記所需要的電泳時(shí)間 . 固定干燥 蛋白質(zhì)凝膠電泳類似于核酸凝膠電泳，但蛋白質(zhì)凝膠要注意濃縮層的輻射作用，并注意將輻射層銷毀處理．如果凝膠層中含有被 32P標(biāo)記的樣品ＤＮＡ，你也可以將其干燥處理后直接用于核酸凝膠電泳．如果凝膠中含有 35S 蛋氨酸樣品必須固定凝膠，洗凈，擴(kuò)增（使用 Amersham 進(jìn)行擴(kuò)增可以大大縮短暴光時(shí)間）放射自顯影，固定凝膠，洗脫 20 min： 50% methanol， 10% acetic acid, 40% water，將凝膠浸泡水中，洗凈，擴(kuò)增裝置中洗滌 20 min，純水中漂洗．如果沒有過多的游離 methione 擴(kuò)散到溶液中，擴(kuò)增裝置可以重復(fù)使用３～４次甚至更多次．這些游離的 methione 會(huì)使電泳的結(jié)果偏大．將凝膠轉(zhuǎn)移到 saran wrap，經(jīng) Whatman 濾紙?zhí)幚?，真空干燥，這樣凝膠中被 32P 標(biāo)記的樣品將暴露出來．除去含有 35S 樣品的凝膠中的 saran wrap．注意在凝膠表面覆蓋一薄片，這樣一來，凝膠層就不會(huì)粘在顯影膠片上了．我運(yùn)用他并使用 kimwipe 是可行的．非放射性 凝膠染色會(huì)造成 coomassie blue，銀的污染．這一方法是全新的，但通常我們不運(yùn)行這一類型的凝膠，因此在這里我就不作詳細(xì)介紹了，如果有誰認(rèn)為自己不需要染色非放射性凝膠．，我會(huì)非常樂意提供一些參考意見． 試劑 RECIPES: 1. Stacking Gel Buffer 125 mM TrisHCl。 available from GIBCOBRL PREPARING A PROTEIN GEL: Three basic reagents are required that can be prepared from the list of materials above: (1) acrylamide gel buffers, (2) electrophoresis buffer, and (3) sample loading buffer. 第一步 準(zhǔn)備 ProteinGel Electrophoresis 通常我是采用 20CM 的玻璃盤制備蛋白凝膠 ,偶爾也會(huì)使用 Hoffer minigel 系統(tǒng)運(yùn)行制備 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白凝膠通常有兩層 ,最高層是濃縮膠 ,含有 1020% 的凝膠高度 ,濃縮膠中 acylamide 的含量比例比較低 ,一般為%,緩沖液 pH 為 acrylamide,包括剩余的凝膠 ,分離的凝膠 .凝膠分離層中 acrylamide的濃度根據(jù)待分離的樣品不同進(jìn)行設(shè)定 .一般來說 ,所使用的是 815% acrylamide,分離膠的 pH 為 縮膠與分離膠界面的 PH 和膠濃度的差，可以起濃縮 樣本的作用，并且可以提高分離膠的分辨率，使條帶更窄更好看。. MATERIALS PBST: PBS (PhosphateBuffered Saline) + % Tween20 Resuspension Buffer: PBST + 2mM EDTA + % bME Thrombin Cleavage Buffer: Any buffer between pH with Ca++ is adequate. Try 50mM TRIS pH + 150mM NaCl + CaCl2 + % bME 50% Glutathione Agarose Beads (GST Beads) beads per 50ml: Rehydrate beads in large volume of water for at least an hour. Wash with several volumes PBST through Whatman filter on a Buchner funnel to remove maltose stabilizer. Collect gel and add equal volume of PBST. Store at 4C. Do not freeze beads are fragile and ice crystals will destroy. Ampicillin: , filter , store at 20C in 1ml aliquots. Use 1:1000. IPTG: stock solution: , store at 20C in 1ml aliquots Alternate 5x solution: 5g/42ml PMSF: stock solution in DMSO。 in ml eppendorf tubes. Wash the beads 4X with PBST ( % bME optional) and 2X with thrombin cleavage buffer. Stop here if protein bound to beads is needed for binding study. Resuspend the beads in 150 ul thrombin cleavage buffer and add ug thrombin . Incubate at room temperature with mixing for 1 hour. Recover the supernatant containing the fusion protein by centrifugation. Stop the reaction with ul PMSF. Incubate at room temperature 1539。 4C 離心至細(xì)胞碎片沉于離心管底部 ,取上清 , 70176。 VII DNA 酶切 1 和 10X buffer 2. III. GST 融合蛋白 細(xì)菌的生 長(zhǎng)和收獲 取 100 ul ampicillin 加入到 100 ml LB 中 ,接種 ,過夜生長(zhǎng) . 早上把過夜的肉湯加入到 900 ml 預(yù)溫 LB 中 ,生長(zhǎng)一個(gè)小時(shí)或加 . Ampicillin 助于質(zhì)粒生長(zhǎng) .如果需要使用甘油過夜培養(yǎng) ,加入 1 ml IPTG (終濃度為 )到 1L培養(yǎng)液中 ,培養(yǎng) 3~5 小時(shí) ,或在其誘導(dǎo)感應(yīng)前除去