【正文】 6 μ l 緩慢混合，室溫下孵育 5 分鐘。 C 熱休克 30 秒，然后立刻將試管轉(zhuǎn)移到冰上 . 室溫下加入 250 μ l . Medium. 37 176。 下列各項(xiàng)有從手冊(cè)被再生而且注解基於對(duì)有經(jīng)驗(yàn)者的裝備。不旋渦 ,否則將會(huì)造成 genomic DNA 分子受剪切力作用機(jī)會(huì)增多。 旋轉(zhuǎn)離心 60 秒以獲得比較好的擴(kuò)增產(chǎn)物。 棄上清，繼續(xù)離心 1 min 除去 buffer。舉個(gè)例子來(lái)說(shuō) , 如果你在 Buffer EB 中洗脫樣品， 并且要用洗脫所得樣品進(jìn)行限制性酶切 ,那麼混雜在樣品中的鹽將影響酶切所得的鹽量。 microfuge 中 PE洗滌后，干燥。雖然這樣一來(lái)增加了一個(gè)步驟，但是花費(fèi)在這一步上的時(shí)間會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比你在等待了三天之后卻發(fā)現(xiàn)你擴(kuò)增出來(lái)的系列不能使用要好得多了！ V. DNA 連接酶 任何人都應(yīng)該自主地把自己當(dāng)作是這個(gè) protocol 的負(fù)責(zé)人 .你不必因?yàn)槟闶秦?fù)責(zé)人你才用心去做。 T4 DNA 連接酶被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)中 DNA分子的連接以及粘性末端、平末端的連接。插入物 ~宿主菌的摩 爾比例從 1:1 到 10:1 變化調(diào)適。 C 孵育 30 min . ligase 65 176。產(chǎn)生的白色沉淀物是依照 NEB 設(shè)定的 BSA。使用熱鈍化的 ligase，能夠消除這個(gè)抑制作用，然 而， 依照 NEB FAQ，熱鈍化的 PEG（存在于酶聯(lián)反應(yīng)中的）也能抑制該變形轉(zhuǎn)換作用 ,因此如果你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在上述問(wèn)題時(shí)，建議您在進(jìn)行轉(zhuǎn)換之前先進(jìn)行 spincolumn 純化。. MATERIALS PBST: PBS (PhosphateBuffered Saline) + % Tween20 Resuspension Buffer: PBST + 2mM EDTA + % bME Thrombin Cleavage Buffer: Any buffer between pH with Ca++ is adequate. Try 50mM TRIS pH + 150mM NaCl + CaCl2 + % bME 50% Glutathione Agarose Beads (GST Beads) beads per 50ml: Rehydrate beads in large volume of water for at least an hour. Wash with several volumes PBST through Whatman filter on a Buchner funnel to remove maltose stabilizer. Collect gel and add equal volume of PBST. Store at 4C. Do not freeze beads are fragile and ice crystals will destroy. Ampicillin: , filter , store at 20C in 1ml aliquots. Use 1:1000. IPTG: stock solution: , store at 20C in 1ml aliquots Alternate 5x solution: 5g/42ml PMSF: stock solution in DMSO。 pH % SDS ml To make a 4X Stock (500ml) g Tris base。 189。l 5 M NaCl 400 181。 1 mM EDTA) 600毫升溶液 : g Tris ml ， EDTA pH用約 7滴濃鹽酸調(diào)至 ，用巴斯德吸管 (穿酸橡皮手套 )或 4 ml ， 1 M HCl. 600 毫升 QS 用水和高壓器 . RNAse (10 mg/ml) RNAse 在水中溶解，煮沸五分鐘 . 貯存在 20176。 的原始體積 . 3次 . .吹入 N2 氣體 第 2天 DNA 溶液加到 10毫米氯化鈉 . 到 100毫克 /毫升 ,在 37176。d to with HCl 10% SDS (or g solid) ~350 ml ddH2O Buffer 25 mM Tris。 available from GIBCOBRL PREPARING A PROTEIN GEL: Three basic reagents are required that can be prepared from the list of materials above: (1) acrylamide gel buffers, (2) electrophoresis buffer, and (3) sample loading buffer. 第一步 準(zhǔn)備 ProteinGel Electrophoresis 通常我是采用 20CM 的玻璃盤制備蛋白凝膠 ,偶爾也會(huì)使用 Hoffer minigel 系統(tǒng)運(yùn)行制備 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白凝膠通常有兩層 ,最高層是濃縮膠 ,含有 1020% 的凝膠高度 ,濃縮膠中 acylamide 的含量比例比較低 ,一般為%,緩沖液 pH 為 acrylamide,包括剩余的凝膠 ,分離的凝膠 .凝膠分離層中 acrylamide的濃度根據(jù)待分離的樣品不同進(jìn)行設(shè)定 .一般來(lái)說(shuō) ,所使用的是 815% acrylamide,分離膠的 pH 為 縮膠與分離膠界面的 PH 和膠濃度的差，可以起濃縮 樣本的作用，并且可以提高分離膠的分辨率，使條帶更窄更好看。 VII DNA 酶切 1 和 10X buffer 2. III. GST 融合蛋白 細(xì)菌的生 長(zhǎng)和收獲 取 100 ul ampicillin 加入到 100 ml LB 中 ,接種 ,過(guò)夜生長(zhǎng) . 早上把過(guò)夜的肉湯加入到 900 ml 預(yù)溫 LB 中 ,生長(zhǎng)一個(gè)小時(shí)或加 . Ampicillin 助于質(zhì)粒生長(zhǎng) .如果需要使用甘油過(guò)夜培養(yǎng) ,加入 1 ml IPTG (終濃度為 )到 1L培養(yǎng)液中 ,培養(yǎng) 3~5 小時(shí) ,或在其誘導(dǎo)感應(yīng)前除去 100 ul 細(xì)胞 并加入 100 ul SDSPAGE sample buffer,一過(guò)性煮沸 ,取出 10 ul 做 SDSPAGE,數(shù)次沖洗 DNA 碎片 ,可獲得較明顯的帶紋 .每 隔一小時(shí)收集一次樣品以確定誘導(dǎo)的時(shí)間 . 500 ml 離心瓶中加入培養(yǎng)液 ,5K 1039。 由于 ligase buffer 中的 ATP 不穩(wěn)定，其活性容易隨 著多次冰凍 / 溶解而降低 ,因此你可能需要從最初的tube管吸取 1020 ul ligase 。 C 儲(chǔ)存。 方法 往 mL 無(wú)菌 tube中加入適當(dāng)?shù)恼麴s水 加入 1 μ L ligation buffer。最常見(jiàn)的是用于將插入的 DNA 分子連接到 plasmid ， 并為宿主菌的變形轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備。 DNA 連接酶是用于兩個(gè) DNA 分子末端的連接 (包括相同的或不同的 DNA分子 )。 鹽的污染可能來(lái)自起始階段的溶菌過(guò)程，或是使用 PB洗脫對(duì)后續(xù)反應(yīng)不良影響通常會(huì)比 EB提高 20%(小劑量的 10 mM Tris 對(duì)樣品 DNA序列反應(yīng)的影響是可以忽略的 )。 Notes 如果你同時(shí)做較多的超過(guò) ~10 minipreps ，能大大節(jié)省將樣品裝載、卸載進(jìn)離心分離機(jī)后，轉(zhuǎn)換成 vacuum manifold version 的時(shí)間。關(guān)于這一步的操作，他們的做法是正確的。這一步驟可以消除 nuclease 酶 活性。 不允許 lysis反應(yīng)超過(guò) 5min 。而純化洗凈低拷貝的 plasmids 、 cosmids ，大分子 plasmids(10 kb) 和 DNA制備使用其他的方法 ,在第 37 頁(yè)上表示推薦 . 在第 19 頁(yè) 21 上在開(kāi)始之前仔細(xì)請(qǐng)讀 重要前言 。 取 1050 μ l菌液在 100 μ g/ml spectinomycin 預(yù)熱的 LB agar 平板上培養(yǎng)， 37176。 轉(zhuǎn)換 Shot174。 結(jié)束 PCR 過(guò)程。 也，在這個(gè)步驟期間，并加入終止劑終止 Taq DNA Polymerase 活性。 C 。如果擴(kuò)增得到的 DNA GC 含量比較高 ,變性時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)到 34mi。如果 GC 的含量是 50%，開(kāi)始變性的溫度定為 95 176。 Taq DNA 聚合酶 u Taq DNA Polymerase 常用于反應(yīng) 50 μ l 混合體系中 。 金額上限模板脫氧核糖核酸通常增加出產(chǎn)量未指明的 PCR產(chǎn)品，但， 如果綜合的保真度是關(guān)鍵的，應(yīng)該用于最大的允許的模板脫氧核糖核酸數(shù)量與 PCR周期一起的有限數(shù)字增 加百分比“改正” PCR產(chǎn)品。除了引物和 Taq DNA 聚合酶外 , 所有的試劑都須經(jīng)高壓滅菌處理 , 并且要將試劑小劑量分裝貯存在指定的 PCR 反應(yīng)管中 ,并與其他的 DNA 樣品分離開(kāi)來(lái)。 TA Cloning— to create a Gateway174。 設(shè)置這個(gè)反應(yīng)方法使吸取錯(cuò)誤的可能性減到最小并且通過(guò)減少試劑調(diào)動(dòng)的數(shù)量節(jié)省時(shí)間。 引物 引物設(shè)計(jì)原則： 引物的長(zhǎng)度一般以 1530 個(gè)核苷酸為宜 .引物長(zhǎng)則特異性高 ； C+G 堿基含量在引物中的比例應(yīng)該控制在 4060%為宜 .引物的 3’端尤其要避免重復(fù)的 CG 堿基序列，否則會(huì)使引物在模板的 GC富集區(qū)錯(cuò)誤配對(duì)； 兩條引物之間的序列不可互補(bǔ)，以免形成二聚體或發(fā)夾式結(jié)構(gòu) ； 引物兩端的溶解溫度變化不宜超過(guò) 5176。 反應(yīng)封閉 . 如果有必要，則用半容量的礦物油覆蓋樣品或增加適當(dāng)?shù)南喈?dāng)數(shù)量石蠟油 (熔化的溫度 5060176。 如果 95 176。同時(shí)，由于加入 DMSO 和 formamide 以后，會(huì)使 50%Taq DNA Polymerase 的活性受到抑制，因此要求所加入的酶稍多于試劑盒的推薦使用量。若擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度小于 2kb，則延伸時(shí)間大概為 1min，若 DNA 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度比較大，則延伸時(shí)間按每增加 1000bp 延長(zhǎng) 1min計(jì)算 . 循環(huán)次數(shù) 在反應(yīng)混合體系中 PCR 的循環(huán)次數(shù)取決于模板 DNA 的數(shù)量以及 擴(kuò)增反應(yīng)的目的。 TA Cloning— to create a Gateway174。 Cloning reactions 復(fù)制反應(yīng)使用試藥在那 命令顯示。 Cloning 到 One Shot174。 ( catalog numbers 19051 號(hào)和 19101) 實(shí)驗(yàn)步驟 這一步可以參照 the Qiagen Spin Miniprep Kit 裝備