【正文】 100 ul 細(xì)胞 并加入 100 ul SDSPAGE sample buffer,一過(guò)性煮沸 ,取出 10 ul 做 SDSPAGE,數(shù)次沖洗 DNA 碎片 ,可獲得較明顯的帶紋 .每 隔一小時(shí)收集一次樣品以確定誘導(dǎo)的時(shí)間 . 500 ml 離心瓶中加入培養(yǎng)液 ,5K 1039。使用熱鈍化的 ligase，能夠消除這個(gè)抑制作用，然 而， 依照 NEB FAQ，熱鈍化的 PEG（存在于酶聯(lián)反應(yīng)中的）也能抑制該變形轉(zhuǎn)換作用 ,因此如果你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在上述問(wèn)題時(shí)，建議您在進(jìn)行轉(zhuǎn)換之前先進(jìn)行 spincolumn 純化。 ligation 之前 ,微熱 (37 176。 如果你所使用的 ligation 有問(wèn)題 ,可以向 NEB FAQ39。 由于 ligase buffer 中的 ATP 不穩(wěn)定，其活性容易隨 著多次冰凍 / 溶解而降低 ,因此你可能需要從最初的tube管吸取 1020 ul ligase 。產(chǎn)生的白色沉淀物是依照 NEB 設(shè)定的 BSA。 Ligase 65176。反應(yīng)條件是：質(zhì)粒載體 50 ng，按插入 DNA片段與質(zhì)粒 2:1的摩爾比例，加入標(biāo)準(zhǔn) T4 ligase， 置 16 176。 C 儲(chǔ)存。 C 孵育 30 min . ligase 65 176。 加入適量的宿主載體。 由于 buffer 含有 ATP， 因此反復(fù)冰凍、解凍溶解將降低 ATP活性從而影響連接酶的催化作用。 方法 往 mL 無(wú)菌 tube中加入適當(dāng)?shù)恼麴s水 加入 1 μ L ligation buffer。插入物 ~宿主菌的摩 爾比例從 1:1 到 10:1 變化調(diào)適。 mono ，容易產(chǎn)生質(zhì)粒聚合體，如果過(guò)低那麼結(jié)果可能是線的和圓形的 homo 和 heteropolymers。 如果用 于插入 DNA的質(zhì)粒鏈的比率過(guò)高，超過(guò) 39。最常見(jiàn)的是用于將插入的 DNA 分子連接到 plasmid ， 并為宿主菌的變形轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備。 T4 DNA 連接酶被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)中 DNA分子的連接以及粘性末端、平末端的連接。這一酶素用于連接 DNA 片段鈍性末端或平末端 ,粘性末端。末 端核甘和 5’磷酸之間磷酸二酯鍵的形成。 DNA 連接酶是用于兩個(gè) DNA 分子末端的連接 (包括相同的或不同的 DNA分子 )。雖然這樣一來(lái)增加了一個(gè)步驟，但是花費(fèi)在這一步上的時(shí)間會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比你在等待了三天之后卻發(fā)現(xiàn)你擴(kuò)增出來(lái)的系列不能使用要好得多了！ V. DNA 連接酶 任何人都應(yīng)該自主地把自己當(dāng)作是這個(gè) protocol 的負(fù)責(zé)人 .你不必因?yàn)槟闶秦?fù)責(zé)人你才用心去做。旋轉(zhuǎn)穿越只能降低對(duì)一個(gè)混合之后殘余的鹽水平，為比較好的解決這個(gè)難題 ,我使用約 300500 μ L PE進(jìn)行兩次洗滌 . 第一次洗滌的時(shí)候 ,我沿著反應(yīng)管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)使沾在加樣槍表面的反應(yīng)液脫落到反應(yīng)管中。反應(yīng)過(guò)程中鹽的污染有二 個(gè)主要來(lái)源 : 反應(yīng)管邊沿沾附的及使用 PE 洗脫過(guò)程中殘余的 PB。 鹽的污染可能來(lái)自起始階段的溶菌過(guò)程，或是使用 PB洗脫對(duì)后續(xù)反應(yīng)不良影響通常會(huì)比 EB提高 20%(小劑量的 10 mM Tris 對(duì)樣品 DNA序列反應(yīng)的影響是可以忽略的 )。 microfuge 中 PE洗滌后，干燥。我們可以使用室溫水來(lái)獲得比較好的 產(chǎn)品，使用 Knight lab 去離子水洗脫也可以獲得比較好的產(chǎn)品。這一步操作 可以參考 sequencing center。 Notes 如果你同時(shí)做較多的超過(guò) ~10 minipreps ，能大大節(jié)省將樣品裝載、卸載進(jìn)離心分離機(jī)后，轉(zhuǎn)換成 vacuum manifold version 的時(shí)間。舉個(gè)例子來(lái)說(shuō) , 如果你在 Buffer EB 中洗脫樣品， 并且要用洗脫所得樣品進(jìn)行限制性酶切 ,那麼混雜在樣品中的鹽將影響酶切所得的鹽量。在某些情況下，這樣可以有效提高樣品中 DNA 的濃度。往每一支 QIAprep spin column 中加入 50 μ l Buffer EB (10 mM , pH )或滅菌蒸餾水洗脫 DNA，靜置 1min， 離心 1min。關(guān)于這一步的操作，他們的做法是正確的。 棄上清，繼續(xù)離心 1 min 除去 buffer。 加入 ml 的 Buffer PE 沖洗 QIAprep spin column ，離心 30 ~60 s。 雖然說(shuō)這個(gè)步驟僅供選擇，但是實(shí)際上它并不影響到產(chǎn)品的擴(kuò)增，當(dāng)使用 XL－ 1和 DH alpha 作宿主菌時(shí)， 你可以省去這些洗滌步驟 ....你可以認(rèn)為你正在操作 endA菌株，而實(shí)際他們是 endA＋菌株。這一步驟可以消除 nuclease 酶 活性。 旋轉(zhuǎn)離心 60 秒以獲得比較好的擴(kuò)增產(chǎn)物。就會(huì)形成一個(gè)壓的白色圓球。 避免局限性沉淀 , 小心而充分混勻，立即加入 Buffer N3, 立即產(chǎn)生渾濁。 不允許 lysis反應(yīng)超過(guò) 5min 。不旋渦 ,否則將會(huì)造成 genomic DNA 分子受剪切力作用機(jī)會(huì)增多。 加入 250 μ l Buffer P2 并且顛倒 tube 46 次混勻。 實(shí)驗(yàn)步驟 250 μ l buffer P1 中 (4 176。而純化洗凈低拷貝的 plasmids 、 cosmids ，大分子 plasmids(10 kb) 和 DNA制備使用其他的方法 ,在第 37 頁(yè)上表示推薦 . 在第 19 頁(yè) 21 上在開(kāi)始之前仔細(xì)請(qǐng)讀 重要前言 。 下列各項(xiàng)有從手冊(cè)被再生而且注解基於對(duì)有經(jīng)驗(yàn)者的裝備。 如果你以前從未做這個(gè)記錄 , 在手冊(cè)中讀背景數(shù)據(jù)。 Buffer P1 （你也可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)）： 50 mM TrisHCl pH 10 mM EDTA 10 μ g/ml RNaseA ordered 和 RNaseA 也可以按 Qiagen 設(shè)定。 取 1050 μ l菌液在 100 μ g/ml spectinomycin 預(yù)熱的 LB agar 平板上培養(yǎng)， 37176。 C 熱休克 30 秒，然后立刻將試管轉(zhuǎn)移到冰上 . 室溫下加入 250 μ l . Medium. 37 176。 chemicallypetent E，小心混勻 . 冰上孵育 5 到 30 分鐘。 E. coli .加入 2 μ l Shot174。 轉(zhuǎn)換 Shot174。 Vector 1 μ l 總體積 6 μ l 緩慢混合，室溫下孵育 5 分鐘。對(duì)于 electroporation ，稀釋 4fold 鹽溶液。 使用下列試劑建立以下 TOPO174。 結(jié)束 PCR 過(guò)程。 Cloning，我們建議您按照手冊(cè)中所提供的詳細(xì)方案記錄進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 entry clone Invitrogen TOPO TA cloning kit 以下程序是供有經(jīng)驗(yàn)的 TOPO174。 II. TOPO174。 也，在這個(gè)步驟期間，并加入終止劑終止 Taq DNA Polymerase 活性。 后續(xù)延伸階段 在最後一個(gè)周期之後，樣品通常置于 72 176。 對(duì)于模板 DNA 小于 10 ，循環(huán)次數(shù)一般為 40 個(gè)。 C，在這個(gè)溫度下 Taq DNA Polymerase 具有較高的酶促活性，有利于 DNA 的復(fù)制。 C 。 C 并孵育 min 就足夠了。此外 , 可用 dGTP 7 deaza 替代反應(yīng)體系中的 dGTP，從而降低 PCR 產(chǎn)品的熔化溫度。加入這些試劑以后，引物 — 模板DNA的溶解溫度會(huì)發(fā)生比較大的變化，因此采用的退火溫度要根據(jù)實(shí)驗(yàn)本身具體確定。如果擴(kuò)增得到的 DNA GC 含量比較高 ,變性時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)到 34mi。 C 時(shí)酶的活性會(huì)迅速降低 . 變性階段 由于第一擴(kuò)增周期得到的 PCR產(chǎn)物通常都比模板 DNA 短，因此通常在 9495 176。 C 變性 時(shí)間沒(méi)有達(dá)到 3min， Taq DNA 聚合酶錯(cuò)配的幾率增加。 若 GC含量大于 50%，則變性時(shí)間要延長(zhǎng)到 10MIN。如果 GC 的含量是 50%，開(kāi)始變性的溫度定為 95 176。 起始變性階段 DNA 模板的完全變性 是 PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵。 C) 。 然而，如果反應(yīng)混合物中混有抑制劑 (舉例來(lái)說(shuō) , 如果反應(yīng)使用的模板 DNA純化程度不 夠高 ），比較高含量的 Taq DNA 聚合酶 (23 u) 可能獲得更高的擴(kuò)增產(chǎn)物率。 Taq DNA 聚合酶 u Taq DNA Polymerase 常用于反應(yīng) 50 μ l 混合體系中 。除此之外 , MgCl2 的濃度選擇主要是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定 , 以 1mM 為起始體積每 mM 逐步增加 , 直到獲得一定產(chǎn)量的 PCR 產(chǎn)物。 C，因此必須適當(dāng)選擇 GC的含量比例及長(zhǎng)度 ； dNTPs 反應(yīng)混合體系中的 dNTP 的濃度通常是 200μ M. 它要求反應(yīng)體系中每一 dNTP(dATP 、 dCTP 、 dGTP,dTTP) 的濃度均相同 , 如果某一種 dNTP 的濃度不平衡增加反應(yīng)時(shí)將會(huì)大大增加 DNA 聚合酶錯(cuò)配機(jī)率。 雖然用于脫氧核糖 核酸 洗凈規(guī)程的甚而痕量代理 (酚、乙二胺四乙酸、蛋白酶 K等等 )強(qiáng)烈禁止 Taq 脫氧核糖核酸聚合酶、脫 氧核糖核酸的對(duì)氨基苯甲酸二降雨雪和脫氧核糖核酸藥丸的反復(fù)治療與 70%對(duì)氨基苯甲酸二通常是有效的 在去除污染物蹤影從脫氧核糖核酸樣品。 金額上限模板脫氧核糖核酸通常增加出產(chǎn)量未指明的 PCR產(chǎn)品，但， 如果綜合的保真度是關(guān)鍵的，應(yīng)該用于最大的允許的模板脫氧核糖核酸數(shù)量與 PCR周期一起的有限數(shù)字增 加百分比“改正” PCR產(chǎn)品。 如果熱量 cycler 裝備一個(gè)激昂的盒蓋，這 一步 可 以省略。 二 .配制反應(yīng)混合體系 。有關(guān) PCR 實(shí)驗(yàn)室裝備和儀器維護(hù)的詳細(xì)指令在 PCR 方法和應(yīng)用軟件 3,2,S1S14,1993 中可以查找得到 . 一 .反應(yīng)混合體系的準(zhǔn)備 建立多個(gè)平行反應(yīng)體系 ,在單一反應(yīng)混合管中加入水 ,dNTPs ，引物和 Taq DNA 聚合酶 , 然后 分別 進(jìn)入 各 管中 進(jìn)行 消化，接著添加適量 MgCl2 和模板 DNA 。除了引物和 Taq DNA 聚合酶外 , 所有的試劑都須經(jīng)高壓滅菌處理 , 并且要將試劑小劑量分裝貯存在指定的 PCR 反應(yīng)管中 ,并與其他的 DNA 樣品分離開(kāi)來(lái)。 建議使用裝備有紫外線燈的 Laminar 流程內(nèi)閣裝置來(lái)混合反應(yīng)試劑 . 應(yīng)該為脫氧核糖核酸洗凈和每個(gè)反應(yīng)設(shè)定佩帶新鮮的手套 . 進(jìn)行 DNA 樣品和反應(yīng)混合準(zhǔn)備時(shí) , 我們強(qiáng)烈推 薦使用熱衷的船加樣槍及氣溶膠濾膜。 entry clone III. Transformation