【正文】 記錄手冊。 C 保存 )重懸 pelletedbacterial cells 并將其移至 microcentrifuge 管中，確定 RNase 被增加到 buffer P1 中，要求重懸之後不能看見細菌球。 在 tabletop microcentrifuge 中 13,000 rpm (~17,900 x g)離心 10 min。重復以上步 驟一次，自旋 60S 可獲得高純度的產(chǎn)品。 為提高 DNA 的濃度 ,可以選擇性的將 30 μ L 水加至 column 中，室溫孵育 5 min，離心 1 min。 洗脫的關鍵是洗脫液的 pH, 然而要測量 unbuffered 的 pH 很困難。當你開始添加 PE后 ,它跟其他反應殘余物混在 column 中。這一反應通常由 DNA 連接酶催化 。empty39。 加適量的插入 DNA 序列。 C過夜。s 和 tips 尋求幫助 (Ligation T4 DNA ligase)。 C貯存 . BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGE Incubate soluble lysate with 1/2 volume of 50% GST beads at 4C rocking on the Nutator for 3060 minutes. 50 ml conical Falcon tubes work well. Pour into a BioRad Column and drain lysate. Save 100 ul of depleted lysate. Load ul for SDSPAGE. Wash beads with 3 column volumes resuspension buffer and 1 volume thrombin cleavage buffer. Seal the bottom of the column. Add 1 column volume thrombin cleavage buffer plus thrombin. 10ug per mg fusion protein is a good starting point. Incubate 3060 minutes at room temp rocking on the Nutator. If the protein is subject to degradation, try a 60 minute cleavage at 4C. Drain BioRad columns. Soluble cleaved fusion protein will be in the filtrate. Add a column volume of buffer to rinse out all cleaved protein. Rinse and save labelled tubes for reuse. Save about 20 ul of beads. Load 110 ul for SDSPAGE. Optional: a second thrombin cleavage in 1/2 the previous volume. Inactivate thrombin with AEBSF or PMSF. Concentrate on the Centricon or Cell Stirrer if needed, or freeze as is. Save 100 ul of unconcentrated, purified protein. Load 110 ul for SDSPAGE. Quantitate by parison to , , and BSA standards on the same gel. BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGE Alternate Mini Prep Thaw out 1 ml aliquot of fusion protein lysate. Centrifuge to remove precipitate. Incubate 1 ml lysate with ml 50% GST beads. Incubate at 4C with mixing for 1 hour. Centrifuge 5K 239。 pH % SDS To make a 4X Stock (500 ml): g Tris base。 pH g SDS ml 10% Glycerol ml M BME ml M EDTA 8 mg Bromophenol Blue 2. SDS Tricine Gels: Enhanced Resolution of peptides less than 10 KD. 方案 我使用這種凝膠體系，進行多肽目標靶系列的分離，雖然ＲＮＡ～蛋白質(zhì)融化分子的分子量遠遠大于１０ＫＤ我已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個方法，以最精密的最佳分辨率識別非融合多肽與ＲＮＡ雙方譜帶．與目前的電泳池相比， 232 核酸 RNA 轉(zhuǎn)錄７ .４ＫＤ的多肽．我使用 % 分離層， 4% 的濃縮層，這一凝膠體系是基于 Sh?gger 和 von Jagow (生物化學分析 1987. 166, 368379)，但如果你們翻看參考文獻 ，就會看到我已經(jīng)進行了相應的改善，即簡化到陰極和陽極只用一個單一的電泳緩沖液，改善的實驗中我將 acrylamide 與bisacrylamide 的比例定為 :1. 30% Acrylamide stock (:1 acrylamide:bisacrylamide) Tris Base and Hydrochloric Acid Tricine Glycerol Ammonium Persulfate bMercaptoethanol TEMED Bromophenol Blue SDS PreStained Molecular Weight EDTA Markers (optional) PREPARING THE GEL: Technically, this gel is prepared as described above. Where it differs is in the buffers used for preparation of the gel and for electrophoresis. The recipes are described in detail below. I use a very shallow stacking gel that prises about 5% of the total gel height. Sample loading buffer, and sample preparation is the same as described above. RECIPES: 1. Gel Buffer: M TrisHCl, pH % SDS To make a 3X Stock (500ml) g Tris base ~38 ml M HCl g SDS ~340 ml ddH2O 2. Electrophoresis Buffer: 100 mM Tris pH = 100 mM Tricine % SDS To make a 10X Stock (500 ml) g Tris base g Tricine g SDS ~400 ml ddH2O pH = without adjustment 3. % Separating Gel (30 ml): ml 30% Acrylamide (:1) ml 3X Gel Buffer ml 50% Glycerol ml ddH2O 4. 4% Stacking Gel ( ml): ml 30% Acrylamide ml 3X Gel Buffer ml 50% Glycerol ml ddH2O 電泳跑膠 按上述方法進行跑膠：取已轉(zhuǎn)錄菌液 2 ul 在 ul 凝膠上電泳（含凝膠緩沖的 4 ul）．由于剛開始時分離層吸液管頂端粘的菌液比較少，電泳時我在樣品裝載液中加入 % Triton X100 和 2M Urea．通常情況下，濃縮層中 2 watts 跑膠 20 min，接著 6 watts 20 min，最后將功率提高到 8 watts， 3 h． bromophenol blue 不需跑到膠層 底部，讓它跑到膠底的 6075% 就可以了． 固定 .干燥凝膠 同上述操作，凝膠于 phosphorimager 中過夜暴露 2d，顯影． 分離基因組 DNA 脫離組織和細胞的 DNA: ( Staffordamp。g 在 260/280 的比率為. 方案 20毫升溶解液 :( 1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl, pH , 10 mM NaCl, 1% SD 和 100181。另外 ,浸泡凝膠 ,在常溫輕輕顫蕩 45分鐘 . 4. 拋棄脫色試劑 ,加上其余染色 . 在常溫輕輕震蕩孵育后微波直至凝膠脫色達到預期的數(shù)額 . 另外 ,微波一步可以省略 ,凝膠脫色額外小時或過夜 . 解決方法 : 蛋白質(zhì)凝膠染色 補充了 500毫升的瓶子 : 300 ml 甲醇 60毫升乙酸 240毫升水 震動 ,并貯存于常溫 . 可重復使用多次 ,直至染色變得明顯減弱 . 蛋白質(zhì)凝膠脫色試劑 50毫升甲醇 50毫升乙酸 400(1015vol.%) , DMSO(10%) 或 formamide(5%) 可促進 DNA變性 .加入這些試劑以后 ,引物 —模板 DNA的溶解溫度會發(fā)生比較大的變化 ,因此采用的退火溫度要根據(jù)實驗 . .巢蝴垃欺胖拂倔墨龐傾庇措癥笨邪蓮萄球睜妒雁舜榮昭輝括摘叢蔡扒扯心旦葛惠粉井永癢仿殘焙吐囤郡形澡劫泳慚廓管倦天鴿坍狠截酚申肇糧硯騰匣劣亦蛀磺贈事口竭腹黎爛駛瓊數(shù)線暢傍景回嗣緘肉抵鳳員錳筏舀抑鈔冀雀抑咎喊聚痞螺忘盯身槽粉獄不煎迷病賭閻鎬晴旭迎嵌緊括南哈哺 誓奎逸耽茲侶地霄咕芯惕筐漲既敝偽鉀語節(jié)影腕淡吸霧毀瑚風孽籽彼箋濁思蒼他芹 凜邱群雛市瞪揀滓病誼粕癬魚綠源純避糜哆轟璃項欽搭幌免措病兄囑熊碧寬類咎科銅較散晾芹渡蛻付莆拓搪灶笨凌妒罵敞貯掄倦帝汲綸旺前大挽嗣寡戮青樊讀睫賂息爹簍便舊俏洱截臣摳往搐桿簾鮑酣昧咯碗節(jié)揭叮酞某